structurile LC3-pozitive sunt proeminente în celulele cu deficit de autofagie

materiale

anticorpii utilizați în acest studiu sunt: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) și toți anticorpii secundari conjugați Alexa au fost achiziționați de la Invitrogen. Construcțiile pEGFP-LC3, pEGFP-lc3-G120A și RFP-LC3 au fost Cadouri amabile de la Dr.T. Yoshimori (Universitatea Osaka, Japonia). ATG9A-pEGFP a fost un cadou amabil de la Dr. Y. Takahashi( Penn State College of Medicine, SUA), C1-mcherry a fost de la Clontech (632524), mcherry-p62 și mcherry-P62 LIR mutant (DDDW335-338aaaa) a fost un cadou amabil de la Dr. Sascha Martens (Universitatea din Viena, Austria), p62-pEGFP a fost un cadou amabil de la Dr. Terje Johansen (Universitatea Artic, Norvegia), în timp ce Myc-LC3-G120A-CENTICC22 a fost un cadou de la Dr.T. Yoshimori (addgene plasmid # 45449). Pspcas9 (BB)-2a-Puro (PX459) V2.0 a fost un cadou de la Dr.F. Zhang (addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 a fost un cadou amabil de la Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A și EGFP-LC3F52A au fost create de mutageneza site-ului folosind kitul de mutageneză direcționat pe site Q5 (NEB E0554S) și pEGFP-lc3 ca șablon conform instrucțiunilor producătorului. Primeri utilizați pentru mutația K51A: 5′-ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ‘ și pentru mutația F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

culturi celulare

celulele HeLa au fost cultivate în mediul vultur modificat Dulbecco (DMEM) suplimentat cu ser fetal bovin 10% v/v, 100 U/ml penicilină-streptomicină și 2 mM L-glutamină. Celulele HepG2 au fost menținute în mediul RPMI 1640 suplimentat cu ser fetal bovin 10% v/v, 100 U / ml penicilină-streptomicină, toate obținute din Sigma, MAREA BRITANIE. Liniile celulare au fost menținute prin trecerea celulelor, folosind soluție de tripsină-EDTA (Sigma), după ce acestea sunt sub-confluente la aproximativ 75-90% în baloanele T75 (75 cm2) (Falcon). Linia celulară utilizată pentru acest studiu a fost linia celulară HeLa (Human col uterin cancer cells). În experimentele în care a trebuit să blocăm fluxul autofagic, celulele au fost tratate cu 400 nM de bafilomicină A1 timp de 4 ore la 37 CTC.

transfecție

celulele HeLa au fost transfectate cu plasmida purificată utilizând reactivul de transfecție Mirus TransIT-2020. Transfecția a fost efectuată utilizând mediul optiMEM, utilizând protocolul producătorului. Pe scurt, s-a preparat un amestec de 100 ilqtl de optiMEM cu 1 ilqtg de ADN și s-a incubat la temperatura camerei timp de 5 minute. S-a preparat un alt amestec conținând 100 ilft optiMEM cu 5 ilft de Mirus și s-a incubat timp de 5 minute. Ambele soluții au fost apoi amestecate și incubate timp de aproximativ 20-25 de minute. Volumul total a fost apoi adăugat la un godeu dintr-o placă cu 6 godeuri, conținând deja 1 ml de optiMEM. Cantitatea de ADN utilizată în general pentru transfecție a fost de 1 hectolitru pentru un 6 godeu.

eliminarea mediată de siARN

celulele pentru eliminarea siARN au fost transfectate folosind reactiv de transfecție lipofectamină 2000. Transfecția a fost efectuată utilizând mediul optiMEM, utilizând protocolul producătorului. Pe scurt, s-a preparat un amestec de 100 ilft de optiMEM cu 3 ilft de 20 ilft sau 1 ilft de 100 ilft de siRNA și s-a incubat la temperatura camerei timp de 5 minute. Concomitent, a fost preparat și incubat timp de 5 minute un alt amestec ce conține 100 xilt optiMEM cu 5 xilt de Lipofectamină 2000. Ambele soluții au fost apoi amestecate și incubate timp de aproximativ 20-25 de minute. Volumul total a fost apoi adăugat într-un godeu dintr-o placă cu 6 godeuri, conținând deja 1 ml de optiMEM timp de 4 ore la 37 centimetric C. După incubare, suportul a fost schimbat și înlocuit cu suport complet. Celulele au fost apoi recoltate după 48 de ore de incubație dacă s-a dorit o singură lovitură (KD), ca și pentru ATG7 și ATG10 KD în celulele HeLa. Pentru experimentele de salvare ATG7 și ATG10, un pcDNA.3 (vector gol) sau ATG7 plus ATG10-FLAG au fost utilizate pentru a transfecta celulele la 24 de ore după transfecția siRNA. Pentru studiile duble KD, am efectuat o altă rundă de transfecție a siARN, urmând același protocol menționat mai sus, după prima rundă (pentru studiile KD p62). Pentru eliminarea siARN în celulele HepG2, acestea au fost transfectate folosind reactiv de transfecție Lipofectamină rnai max folosind 100 nM siARN final și s-au efectuat două runde de transfecție a siARN pentru a obține o eliminare eficientă. Celulele au fost apoi împărțite și însămânțate pe plăcile sau capacele respective pentru experimente ulterioare. Scrambled siRNA (on-TARGETplus non-targeting Pool, D-001810-10), human on-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, l-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, l-019426-01) au fost comandate de la Dharmacon și utilizate la o concentrație finală de 50-100 nM.

testele GFP-trap

celulele HeLa au fost transfectate cu EGFP-LC3 folosind reactiv de transfecție Mirus TransIT-2020 și 24 de ore mai târziu au fost lizate în tampon de liză (50 mm HEPES, 150 mM Naci, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mm EGTA) timp de 10 minute pe gheață și granulat timp de 10 minute la 13.000 rpm. Proteinele etichetate cu GFP (EGFP sau EGFP-LC3) au fost trase în jos folosind margele GFP-TRAP (ChromoTek), conform protocolului producătorului. Imunoprecipitatele au fost eluate prin fierberea probelor în tampon laemmli timp de 5 minute. Proteinele au fost rezolvate prin SDS-PAGE.

imunofluorescență

imunocitochimia s-a efectuat pe celule crescute pe 22 învelitori de 22 mm. Celulele HeLa au fost crescute la o confluență de 70-80%, spălate o dată cu PBS și apoi fixate fie folosind 4% g/v PFA timp de 5-7 minute, fie metanol la rece timp de 3-5 minute la 4 C. Rețineți că, deoarece majoritatea anticorpilor utilizați în studiu au funcționat numai la fixarea PFA, probele au fost în general fixate cu 4% g/v PFA în PBS, cu excepția cazului în care se menționează altfel în legenda(legendele) figurii. PFA a fost aruncat în conformitate cu reglementările de siguranță și celulele au fost spălate de trei ori cu PBS. Celulele au fost apoi permeabilizate folosind 0.5% V/V Triton X – 100 timp de 5-7 minute și spălat de trei ori cu PBS pentru a îndepărta orice detergent rezidual. O soluție care conține 1% g/v BSA a fost apoi adăugată pe capace, ca soluție de blocare, pentru a reduce legarea nespecifică a anticorpilor primari și secundari și menținută timp de 1 oră la temperatura camerei. Soluția de blocare a fost apoi exploatată de pe capace și anticorpii primari la diluții adecvate au fost adăugați pe capace. Învelișurile cu anticorpi primari au fost incubate la 4 CTC timp de 16-20 ore într-o cameră umedă și umedă. Capacele au fost apoi spălate de trei ori cu PBS și incubate cu o soluție care conține anticorpi secundari timp de 1 oră la temperatura camerei. (Rețineți că soluțiile primare și secundare de anticorpi au fost făcute în tamponul de blocare.) Diluția anticorpilor secundari utilizați pentru acest studiu a fost 1:400 preparată în soluție 1% g/v BSA. În cele din urmă, capacele au fost spălate de două ori cu PBS și apă sterilă de înaltă puritate și montate pe lamele de sticlă folosind un mediu de montare dapi anti-decolorare Pro-Long gold (Invitrogen, SUA). Capacele au fost apoi imaginate folosind microscopul confocal Zeiss Lsm880 sau LSM780 folosind obiectivul de imersie în ulei 63x.

imagistica cu celule vii

celulele atg16l1-knockout au fost însămânțate pe vasele MatTek (MatTek, Ashland MA USA). A doua zi, aceste celule au fost transfectate cu plasmidă adecvată pe baza cerințelor experimentale folosind reactiv de transfecție Mirus Trans-IT 2020. Transfecția a fost efectuată utilizând mediul optiMEM, utilizând protocolul producătorului. O soluție stoc de 2% Triton X-100 a fost apoi utilizată pentru a atinge concentrația desemnată pentru extracția detergentului din membrana plasmatică. O concentrație finală de 1% Triton X-100 este capabilă să extragă citosolicul și membrana legată. Experimentul pentru a confirma prezența agregatelor p62 în celulele atg16l1-knockout, totuși, a implicat extracția detergenților folosind 1,5% Triton X-100 ca concentrație finală pentru a supune celulele la condiții mai dure de extracție. Imagistica a fost apoi realizată cu ajutorul modulului ‘serii de timp’pe un microscop Zeiss axioobserver Z1 incubat cu un microscop confocal lsm780 folosind un obiectiv de imersie în ulei apochromat plan 63 de la 1,4 na.

microscopie cu Super-rezoluție

probele au fost însămânțate pe capace Zeiss High precision No 1.5 170+ sau -5 inqutm, 18 mm inqut 18 mm. După colorare, probele au fost montate în Pro-Long gold anti-fade dapi mediu de montare (Life Technologies) și lăsate să se întărească timp de 3 zile pentru a atinge un indice de refracție constant (RI) de 1,46. Probele au fost imaginate folosind iluminare structurată pe Elyra PS1 (microscopie Carl Zeiss). După alinierea etapei, liniile laser de 405, 488 și 561 nm au fost utilizate pentru a imagina o stivă de mărgele pentru a corecta aberația cromatică folosind algoritmul de aliniere a canalelor. Stivele Z au fost achiziționate la 5 faze și 5 rotații ale grilei de iluminare și ulterior prelucrate și aliniate folosind software-ul ZEN Black elyra edition (microscopie Carl Zeiss).

extracția fracțiilor solubile și insolubile

extracția fracțiilor solubile și insolubile din celulele atg16l1-knockout a fost efectuată în tampon RIPA. Pe scurt, celulele au fost spălate cu 1x PBS rece ca gheața o dată și au fost răzuite, lizate în 500 unqql de tampon RIPA și colectate în tuburi etichetate păstrate pe gheață. Compoziția tamponului RIPA a fost următoarea –

tampon RIPA

50 mm Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM Naci

5 mm EDTA

1% Triton X-100

0.5% deoxicolat de sodiu

0.1% SDS

la momentul utilizării, tamponul RIPA a fost suplimentat cu comprimate complete de inhibitor de protează (1 comprimat per 50 ml) și cocktail-uri de inhibitor de fosfatază 2 și 3 (1:100 fiecare).

lizații au fost apoi trecuți printr-un ac de 25 G de 10 ori și apoi soluția a fost centrifugată la 14000 rpm timp de 15 minute la 4 centi C. După centrifugare, supernatantul a fost colectat într-un tub Eppendorf proaspăt și a fost etichetat ca fracția solubilă și a fost amestecat cu 300 centi de 2x tampon laemmli și a fost fiert timp de 5 minute. Peleta obținută după centrifugare constă din fracția insolubilă și a fost omogenizată și spălată cu 500 de centicli de tampon RIPA. Soluția omogenizată a fost apoi centrifugată la 14000 rpm, timp de 5 minute, la 4 centimetrii C. supernatantul a fost aruncat și peleta a fost omogenizată în 100 centimetrii de uree + tampon RIPA. Acesta a fost în cele din urmă amestecat cu 100 unqql de 2x tampon laemmli și a fost fiert timp de 5 minute. Compoziția tamponului de uree + RIPA constă din uree suplimentară la o concentrație finală de 2 M împreună cu componentele tamponului RIPA.

Western blot

celulele cultivate în plăci cu 6 godeuri au fost lizate și colectate în 2x tampon laemmli (4% m/v SDS, 20% V/V glicerol, 10% v/v 2-mercaptoetanol, 0,004% m/v bromofenol albastru și 125 mm Tris HCl, pH 6,8). După ce celulele au fost lizate, 20-30 unqql din probe au fost încărcate pe o pagină SDS de 10 godeuri, 12-15% și rulate la 100-120 V. o scară standard M. W. a fost încărcată împreună cu probele pentru a ține evidența mișcării proteinelor din gel. Proteinele au fost apoi transferate PE PVDF activat la 100 V Timp de 60 de minute. Membrana a fost îndepărtată la finalizarea transferului și a fost înmuiată în 5% g/v lapte degresat pentru a bloca locurile de legare nespecifice, timp de 1 oră la temperatura camerei. Apoi, o soluție care conține anticorp primar specific (preparat în 5% m/v lapte degresat) la o diluție adecvată a fost adăugată pe membrană pentru incubare peste noapte la 4 C. membranele au fost apoi spălate de trei ori cu PBST (soluție salină tampon fosfat +0,1% Tween-20) înainte de adăugarea anticorpului secundar. Anticorpul secundar, preparat și în lapte degresat de 5% g / v, a fost incubat cu membrana timp de 1 oră la temperatura camerei. Diluția anticorpului secundar a fost menținută, în general, la 1:4000 pentru anticorpii conjugați HRP cu chemiluminescență îmbunătățită (ECL) și la 1:5000 pentru anticorpii conjugați fluorofori LICOR. Membranele au fost apoi spălate din nou cu PBST de mai multe ori și dezvoltate folosind un amestec de volume egale de soluții de dezvoltare 1 și 2 pentru ECL sau imaginate direct pentru detectarea semnalului de fluorescență folosind software-ul LICOR Image Studio (LICOR, SUA).

CRISPR knockout cell generation

ARN-urile de ghidare au fost concepute pentru generarea de celule knockout ATG9 folosind instrumentul online dezvoltat de Zhang Lab21. Primele trei hituri ARN de ghidare unică (sgRNA) au fost modificate manual pentru a adăuga site-uri de restricție BbsI și aceste secvențe sgRNA de puritate desalinizată au fost comandate de la Invitrogen. Secvența utilizată cu succes pentru atg9 CRISPR knockout a fost:

nucleotidele evidențiate indică suprapunerile adăugate. SgRNA a fost apoi ligat în coloana vertebrală psCas9-2A-puromicină. Plasmidele ligate cu succes sau controlul vectorial Cas9 gol au fost apoi transfectate în celulele HeLa și expresia a fost permisă timp de 24 de ore. Celulele transfectate au fost apoi selectate prin adăugarea de puromicină la celule la o concentrație finală de 2-4 hectolitri/ml. Celulele au fost lăsate să crească până când toate celulele netransfectate au murit. Celulele pozitive au fost apoi tripsinizate, iar numărul de celule a fost evaluat utilizând slide-uri de contesă Invitrogen (suspensie de celule omogene de 10 XLT +10 XLT albastru de Trypan). Pe baza populației de celule vii, 0,2 104 celule au fost aspirate și diluate în serie într-o placă de 96 de puțuri pentru a obține colonii cu o singură celulă. Diluția în serie a fost întotdeauna 1:1 și volumul final din fiecare godeu la sfârșitul diluării a fost menținut la 200 ect. Lizatele celulare au fost apoi încărcate pe pagina SDS, transferate într-o membrană pentru a verifica eliminarea ATG9.

cuantificarea datelor și analiza statistică

imaginile au fost cuantificate folosind modulul implicit ‘Analyze particles’ din ImageJ. În plus, pixelii Co-localizați au fost identificați și un profil a fost generat folosind un algoritm de plugin ImageJ nesupravegheat numit ‘colocalizare’, care a fost dezvoltat de Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). Western blots au fost cuantificate folosind software-ul LICOR Image Studio (LICOR, SUA), iar valorile au fost procesate, analizate și reprezentate grafic folosind programul Excel din suita Microsoft Office.

nivelurile de semnificație statistică pentru comparațiile dintre două grupuri au fost estimate folosind teste t cu o singură coadă sau cu două cozi. Pentru experimentul care a implicat ATG7 și ATG10 KD, a fost utilizat un test T cu o singură coadă pentru a evalua semnificația statistică a datelor. Pentru toate celelalte experimente din acest studiu, a fost utilizat un test T cu două cozi pentru a evalua semnificația statistică a datelor. În această lucrare, valoarea p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic, iar convențiile utilizate pentru a descrie rezultatele în acest articol sunt următoarele: *p 0,05; **p 0,01; ***p 0,001, iar barele de eroare reprezintă abateri standard, cu excepția cazului în care se menționează altfel.