Calmodulina
Las interacciones de Calmodulina con Ca2+ y con NOS
CaM es una pequeña proteína de unión a Ca2+(peso molecular 17 kDa) que consta de dos lóbulos globulares similares conectados por una región de enlace central. Cada lóbulo contiene dos manos E-F que incluyen una hélice N-terminal( hélice E), un bucle coordinador Ca2+ ubicado en el centro y una hélice C-terminal (hélice F) (los dominios de CaM generalmente se etiquetan como 1-4 de terminal N a C). Tras la unión de Ca2+, la CaM es capaz de unirse y activar más de 30 enzimas diana, lo que le permite regular numerosos segundos mensajeros y funciones celulares. La unión y la activación completa de las proteínas diana por la CaM normalmente requiere la ocupación de los cuatro sitios de unión de Ca2+en la CaM. El lóbulo carboxi-terminal contiene dos sitios de unión a Ca2+de alta afinidad, mientras que el lóbulo amino-terminal contiene dos sitios con menor afinidad a Ca2+. Se producen cambios conformacionales en la CaM después de que se une a Ca2+: los residuos superficiales hidrofóbicos se exponen para formar interacciones cruciales de van der Waals con la cara hidrofóbica del sitio de reconocimiento de péptidos objetivo.
La CAM se une a cada subunidad NOS en una estequiometría 1: 1 con una afinidad razonablemente alta. Los estudios de afinidad de unión con péptidos que corresponden a secuencias de reconocimiento de NOS CaM muestran que los tres NOSs muestran diferentes afinidades hacia la CaM, siendo el orden general NOS inducibles por citocinas (iNOS) NOS NOS neuronales (nNOS) ≈ NOS endoteliales (ENOS). El péptido iNOS se une bien a la CaM tanto en presencia como en ausencia de Ca2+, pero los péptidos eNOS y nNOS se unen a la CaM solo en presencia de Ca2+.
Cada lóbulo de la CaM se une a la NOS de forma independiente y muestra diferentes afinidades hacia la NOS. La interacción CaM–nNOS se ha investigado utilizando mutantes CaM y proteínas CAM vegetales. El nNOS muestra un alto grado de especificidad estructural hacia los dominios 1, 3 y posiblemente 4 de la CAM en relación con la activación de la reducción del hemo y la síntesis de NO. Las interacciones CaM-nNOS son particularmente importantes para la transferencia de electrones e involucran la región de cierre de CaM (formada por los dominios CaM 1 y 3) y un residuo de metionina en el dominio 4. Estas regiones de CaM parecen interactuar con regiones aún desconocidas en nNOS que son distintas de su secuencia canónica de unión de CaM. La carga y la longitud del enlazador central también afectan la unión y activación de iNOS a través de la interacción electrostática en el enlazador central y las interacciones hidrofóbicas en el dominio globular de CaM, lo que parece responsable de su estrecha asociación con el iNOS. La disociación de Ca2 + de la CAM unida a NOS ocurre en dos pasos secuenciales: la disociación rápida de Ca2+ del lóbulo N-terminal ocurre primero y corresponde con la inactivación de la síntesis de NO, seguida de una disociación más lenta de Ca2+ del lóbulo C-terminal, que conduce a la disociación de la CaM de la NOS. Los cambios conformacionales ocurren en los péptidos de unión de levas NOS cuando se unen a CaM. Típicamente, los péptidos adquieren una conformación α-helicoidal al interactuar con la LEVA unida a Ca2+. También se produce un cambio conformacional inducido por la CaM en el dominio de la reductasa NOS, indicado por cambios en la fluorescencia de proteínas y flavinas y por un cambio en el patrón de proteólisis de tripsina.
Está disponible una estructura cristalográfica de LEVA cargada con Ca2+unida a un péptido de 20 residuos correspondiente a la secuencia de reconocimiento de leva eNOS. La estructura reveló que el péptido ENOS α-helicoidal se une a la CaM en una orientación antiparalela a través de extensas interacciones hidrofóbicas: los lóbulos N-terminal y C-terminal de la CaM se envuelven alrededor del péptido unido, interactuando con las mitades C – y N-terminal del péptido, respectivamente. Los residuos específicos de McA en la región de cierre y el dominio 4 se colocaron de manera consistente con su importancia determinada por estudios de mutagénesis. La estructura de cristal también sugirió una base para una unión de levas más estrecha en iNOS: debido a que iNOS contiene un mayor número de residuos hidrofóbicos dentro de su secuencia de reconocimiento de CaM correspondiente, se argumentó que estos apoyarían contactos más extensos de van der Waals con CaM y minimizarían la exposición desfavorable a disolventes de residuos hidrofóbicos para favorecer una asociación más estrecha entre CaM y la secuencia de reconocimiento de CaM de iNOS.
La estructura cristalina de un complejo entre Ca2+/CaM y el dominio FMN de iNOS humanos también está disponible. Se identificaron cuatro conformaciones diferentes en la estructura del complejo, lo que demuestra la naturaleza flexible de las interacciones CaM y FMN dominio–dominio. Un puente salino formado entre CaM y el dominio FMN es evidente en la estructura y puede ser importante para transducir el efecto de la unión CaM en las funciones NOS.