Calmodulin

Calmodulin Interazioni con Ca2+ e con NOS

CaM è una piccola proteina legante Ca2+(peso molecolare 17 kDa) costituita da due lobi globulari simili collegati da una regione di linker centrale. Ogni lobo contiene due mani E-F che includono un’elica N-terminale( E helix), un anello di coordinamento Ca2+ situato centralmente e un’elica C-terminale (F helix) (i domini della CAM sono generalmente etichettati come 1-4 da N a C terminal). Al momento del legame Ca2+, CaM è in grado di legarsi e attivare più di 30 enzimi bersaglio, consentendogli di regolare numerosi secondi messaggeri e funzioni cellulari. Il legame e l’attivazione completa delle proteine bersaglio da parte di CaM richiedono tipicamente l’occupazione di tutti e quattro i siti di legame Ca2+in CaM. Il lobo carbossi-terminale contiene due siti di legame Ca2 + ad alta affinità, mentre il lobo amino-terminale contiene due siti con affinità Ca2+ inferiore. Cambiamenti conformazionali si verificano in CaM dopo che si lega Ca2+: i residui idrofobici della superficie diventano esposti per formare le interazioni cruciali di van der Waals con il fronte idrofobo del sito di riconoscimento del peptide dell’obiettivo.

CaM si lega a ciascuna subunità NOS in una stechiometria 1:1 con affinità ragionevolmente elevata. Studi di affinità di legame con peptidi che corrispondono alle sequenze di riconoscimento NOS CaM mostrano che i tre NOSs mostrano diverse affinità verso CAM con l’ordine generale che è NOS inducibile da citochina (iNOS) neur NOS neuronale (nNOS) ≈ NOS endoteliale (eNOS). Il peptide iNOS si lega bene alla CaM sia in presenza che in assenza di Ca2+, ma i peptidi eNOS e nNOS si legano alla CaM solo in presenza di Ca2+.

Ogni lobo di CAM si lega a NOS in modo indipendente e mostra diverse affinità verso NOS. L’interazione CaM–nNOS è stata studiata utilizzando mutanti CAM e proteine CAM vegetali. nNOS mostra un alto grado di specificità strutturale verso i domini CAM 1, 3 e possibilmente 4 per quanto riguarda l’attivazione della riduzione dell’eme e NESSUNA sintesi. Le interazioni CaM-nNOS sono particolarmente importanti per il trasferimento di elettroni e coinvolgono la regione di latch della CAM (formata dai domini CaM 1 e 3) e un residuo di metionina nel dominio 4. Queste regioni di CAM sembrano interagire con regioni ancora sconosciute su nNOS che sono distinte dalla sua sequenza canonica di binding CAM. La carica e la lunghezza del linker centrale influenzano anche il legame e l’attivazione di iNOS attraverso l’interazione elettrostatica nel linker centrale e le interazioni idrofobiche nel dominio globulare di CAM, che sembra responsabile della sua stretta associazione con l’iNOS. La dissociazione Ca2 + dalla CAM NOS-bound avviene in due fasi sequenziali: la rapida dissociazione Ca2+ dal lobo N-terminale avviene per prima e corrisponde all’inattivazione della sintesi NO, seguita da una più lenta dissociazione Ca2+ dal lobo C-terminale, che porta alla dissociazione della CaM da NOS. Cambiamenti conformazionali si verificano nei peptidi NOS CAM-binding quando si legano CAM. Tipicamente, i peptidi acquisiscono una conformazione α-elicoidale dopo l’interazione con Ca2 + bound CaM. Un cambiamento conformazionale CAM-indotto nel dominio della reduttasi di NOS egualmente accade come indicato dai cambiamenti nella fluorescenza della flavina e della proteina e da un cambiamento nel modello della proteolisi della tripsina.

È disponibile una struttura cristallografica di CAM caricata con Ca2+legata a un peptide a 20 residui corrispondente alla sequenza di riconoscimento CAM eNOS. La struttura ha rivelato che il peptide α-elicoidale di eNOS lega alla camma in un orientamento antiparallel con le estese interazioni idrofobiche: i lobi del C-terminale e del C-terminale di CAM avvolgono intorno al peptide legato, interagenti con le metà del C – e del N-terminale del peptide, rispettivamente. I residui specifici della camma nella regione del fermo e nel dominio 4 sono stati posizionati in modo coerente con la loro importanza come determinato dagli studi di mutagenesi. La struttura cristallina ha anche suggerito una base per il legame più stretto della camma in iNOS: poiché iNOS contiene un numero maggiore di residui idrofobi all’interno della sua corrispondente sequenza di riconoscimento CAM, è stato sostenuto che questi avrebbero supportato contatti più estesi di van der Waals con CaM e minimizzato l’esposizione sfavorevole ai solventi di residui idrofobici al fine di favorire una più stretta associazione tra CaM e la sequenza di riconoscimento CAM iNOS.

È disponibile anche la struttura cristallina di un complesso tra Ca2+/CaM e il dominio FMN di human iNOS. Quattro diverse conformazioni sono state identificate nella struttura del complesso, che dimostra la natura flessibile delle interazioni dominio–dominio CaM e FMN. Un ponte di sale formato tra CAM e il dominio FMN è evidente nella struttura e può essere importante per trasdurre l’effetto del legame CAM sulle funzioni NOS.