Kalmodulina

interakcje Kalmoduliny z Ca2+ i z NOS

CaM jest małym białkiem wiążącym Ca2+(Masa cząsteczkowa 17 kDa) składającym się z dwóch podobnych płatów kulistych połączonych centralnym regionem łączącym. Każdy płat zawiera dwie ręce E-F, które zawierają N-końcową helisę (e helix), centralnie położoną pętlę koordynującą Ca2+ i C-końcową helisę (f helix) (domeny CaM są ogólnie oznaczone jako 1-4 od N do C terminal). Po wiązaniu Ca2+ CaM jest w stanie związać i aktywować ponad 30 docelowych enzymów, umożliwiając regulację licznych wtórnych posłańców i funkcji komórek. Wiązanie i pełna aktywacja białek docelowych przez CaM zazwyczaj wymaga zajęcia wszystkich czterech miejsc wiążących Ca2+w CaM. Płat karboksy-końcowy zawiera dwa miejsca wiązania Ca2+o wysokim powinowactwie, podczas gdy płat aminowy zawiera dwa miejsca o mniejszym powinowactwie Ca2+. Zmiany konformacyjne zachodzą w CaM po związaniu Ca2+: hydrofobowe pozostałości powierzchniowe stają się narażone w celu utworzenia kluczowych interakcji van der Waalsa z hydrofobową powierzchnią docelowego miejsca rozpoznawania peptydów.

CaM wiąże się z każdą podjednostką NOS w stechiometrii 1:1 z dość dużym powinowactwem. Badania powinowactwa wiązania z peptydami, które odpowiadają sekwencjom rozpoznawania NOS cam, wykazały, że trzy nos wykazują różne powinowactwa w kierunku CaM, przy czym ogólny porządek to nos indukowany cytokinami (iNOS) ≫ nos neuronalny (nNOS) ≈ nos śródbłonkowy (eNOS). Peptyd iNOS dobrze wiąże się z CaM zarówno w obecności, jak i bez Ca2+, ale peptydy eNOS i nNOS wiążą się z Cam tylko w obecności Ca2+.

każdy płat CaM wiąże się z NOS niezależnie i wykazuje różne powinowactwa wobec NOS. interakcja CaM-nNOS została zbadana przy użyciu mutantów CaM i roślinnych białek CaM. nNOS wykazuje wysoki stopień strukturalnej swoistości wobec domen CaM 1, 3 i ewentualnie 4 w odniesieniu do aktywacji redukcji hemu i braku syntezy. Interakcje CaM-nNOS są szczególnie ważne dla transferu elektronów i obejmują region zatrzaskowy CaM (utworzony przez domeny CaM 1 i 3) i pozostałość metioniny w domenie 4. Te regiony CaM wydają się oddziaływać z nieznanymi jeszcze regionami na nNOS, które różnią się od jego kanonicznej sekwencji wiążącej CaM. Ładunek i długość centralnego łącznika wpływają również na wiązanie i aktywację iNOS poprzez oddziaływanie elektrostatyczne w centralnym łączniku i interakcje hydrofobowe w domenie kulistej CaM, która wydaje się odpowiedzialna za jej ścisłe powiązanie z iNOS. Dysocjacja Ca2+ Z CAM związanego z NOS następuje w dwóch kolejnych etapach: najpierw następuje szybka dysocjacja Ca2+ z N-końcowego płata i odpowiada inaktywacji syntezy NO, a następnie następuje wolniejsza dysocjacja Ca2+ z C-końcowego płata, co prowadzi do dysocjacji Cam Z NOS. Zmiany konformacyjne zachodzą w peptydach NOS wiążących CaM, gdy wiążą cam. Zazwyczaj peptydy nabywają konformację α-spiralną po interakcji z Cam związaną z Ca2+. Indukowana przez CaM zmiana konformacyjna w domenie reduktazy NOS występuje również, na co wskazują zmiany w fluorescencji białek i flawin oraz zmiana wzoru proteolizy trypsyny.

dostępna jest struktura krystalograficzna cam obciążonego Ca2+związana z peptydem 20-resztkowym odpowiadającym sekwencji rozpoznawania CaM eNOS. Struktura ujawniła, że α-spiralny peptyd eNOS wiąże się z CaM w orientacji antyrównoległej poprzez rozległe interakcje hydrofobowe: N-końcowe i C-końcowe płatki CaM owijają się wokół związanego peptydu, oddziałując odpowiednio z C – i N-końcowe połówki peptydu. Specyficzne pozostałości CaM w regionie zatrzasku i domenie 4 rozmieszczono w sposób zgodny z ich znaczeniem określonym w badaniach mutagenezy. Struktura krystaliczna sugerowała również podstawę do ściślejszego wiązania krzywek w iNOS: ponieważ iNOS zawiera większą liczbę hydrofobowych reszt w odpowiadającej mu sekwencji rozpoznawania CaM, argumentowano, że wspierają one szersze kontakty van der Waalsa z CaM i minimalizują niekorzystne narażenie rozpuszczalników na hydrofobowe pozostałości w celu wzmocnienia powiązania między Cam a sekwencją rozpoznawania CaM iNOS.

dostępna jest również struktura krystaliczna kompleksu między Ca2+/CaM a domeną FMN ludzkich iNOS. W strukturze kompleksu zidentyfikowano cztery różne konformacje, które pokazują elastyczny charakter interakcji cam i FMN domena–domena. Mostek solny utworzony między CaM a domeną FMN jest widoczny w strukturze i może być ważny dla transdukcji wpływu wiązania CAM na funkcje NOS.