Las estructuras LC3 positivas son prominentes en células con deficiencia de autofagia

Materiales

Los anticuerpos utilizados en este estudio son: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) y todos los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa se compraron a Invitrogen. Las construcciones pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A y RFP-LC3 fueron regalos amables del Dr. T. Yoshimori (Universidad de Osaka, Japón). ATG9A-pEGFP fue un regalo amable del Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, EE. UU.), C1-mCherry fue de Clontech (632524), mCherry-p62 y mCherry-p62 mutante LIR (DDDW335-338AAAA) fue un regalo amable del Dr. Sascha Martens (Universidad de Viena, Austria), p62-pEGFP fue un regalo amable del Dr. Terje Johansen (Universidad del Ártico, Noruega), mientras que Myc-LC3-G120A-ΔC22 fue un regalo del Dr. T. Yoshimori (plásmido de addgeno # 45449). El pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 fue un regalo del Dr. F. Zhang (plásmido de Addgeno # 62988). pCMV-ATG7 fue un amable regalo de la Dra. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A y EGFP-LC3F52A fueron creados por mutagénesis del sitio utilizando el kit de Mutagénesis dirigida al sitio Q5 (NEB E0554S) y pEGFP-LC3 como plantilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cebadores utilizados para la mutación K51A: 5 ‘- ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3’ y para la mutación F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Cultivo celular

Se cultivaron células HeLa en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% v/v, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina y 2 mm de L-glutamina. Las células HepG2 se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% v/v, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, todo obtenido de Sigma, Reino Unido. Las líneas celulares se mantuvieron mediante el paso de las células, utilizando solución de tripsina-EDTA (Sigma), después de que fueran sub-confluentes a alrededor del 75-90% en matraces T75 (75 cm2 de área) (Falcon). La línea celular utilizada para este estudio fue la línea celular HeLa (Células humanas de cáncer de cuello uterino). En experimentos en los que necesitábamos bloquear el flujo autofágico, las células se trataron con 400 nM de bafilomicina A1 durante 4 horas a 37 °C.

Transfección

Las células HeLa se transfectaron con el plásmido purificado utilizando el reactivo de transfección Mirus TransIT-2020. La transfección se realizó con el medio OptiMem, utilizando el protocolo del fabricante. Brevemente, se preparó una mezcla de 100 µl de OptiMem con 1 µg de ADN y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se preparó otra mezcla que contenía 100 µl de OptiMem con 5 µl de Mirus y se incubó durante 5 minutos. Ambas soluciones se mezclaron y se incubaron durante aproximadamente 20-25 minutos. El volumen total se añadió a un pocillo de una placa de 6 pocillos, que ya contenía 1 ml de OptiMem. La cantidad de ADN generalmente utilizada para la transfección fue de 1 µg para un pocillo de 6.

Reducción mediada por siRNA

Las células para la reducción de siRNA se transfectaron utilizando reactivo de transfección de lipofectamina 2000. La transfección se realizó con el medio OptiMem, utilizando el protocolo del fabricante. Brevemente, se preparó una mezcla de 100 µl de OptiMem con 3 µl de 20 µM o 1 µl de 100 µM de ARNip y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Simultáneamente, se preparó y se incubó durante 5 minutos otra mezcla que contenía 100 µl de OptiMem con 5 µl de lipofectamina 2000. Ambas soluciones se mezclaron y se incubaron durante aproximadamente 20-25 minutos. A continuación, se añadió el volumen total a un pocillo de una placa de 6 pocillos, que ya contenía 1 ml de OptiMem durante 4 horas a 37 ° C. Después de la incubación, los medios se cambiaron y se reemplazaron por medios completos. Las células se recolectaron después de 48 horas de incubación si se deseaba una sola caída (KD), como en el caso de los KD ATG7 y ATG10 en células HeLa. Para los experimentos de rescate ATG7 y ATG10, un pcDNA.se utilizaron 3 (vector vacío) o ATG7 más BANDERA ATG10 para transfectar células 24 horas después de la transfección de ARNip. Para los estudios de doble KD, se realizó otra ronda de transfección de ARNip, siguiendo el mismo protocolo que se mencionó anteriormente, después de la primera ronda (para los estudios de KD p62). Para la reducción de siRNA en células HepG2, estas se transfectaron utilizando reactivo de transfección RNAi max de lipofectamina utilizando siRNA final de 100 nM y se realizaron dos rondas de transfección de siRNA para lograr una reducción eficiente. Las células se dividieron y se sembraron en placas o cubreobjetos respectivos para experimentos posteriores. El siRNA codificado (ON-TARGETplus Non-targeting Pool, D-001810-10), human ON-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) se ordenaron a Dharmacon y se utilizaron a una concentración final de 50-100 nM.

Ensayos GFP-trap

Las células HeLa se transfectaron con EGFP-LC3 utilizando el reactivo de transfección Mirus TransIT-2020 y 24 horas después se lisaron en tampón de lisis (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mm MgCl2, 5 mM EGTA) durante 10 min en hielo y peletizado durante 10 min a 13.000 rpm. Las proteínas etiquetadas con GFP (EGFP o EGFP-LC3) se bajaron utilizando perlas de trampa GFP (ChromoTek), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Inmunoprecipitados se eluyen por ebullición de las muestras en tampón Laemmli durante 5 min. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE.

Inmunofluorescencia

La inmunocitoquímica se realizó en células cultivadas en cubreobjetos de 22 × 22 mm. Las células HeLa se cultivaron a una confluencia del 70-80%, se lavaron una vez con PBS y luego se fijaron utilizando PFA al 4% p/v durante 5-7 minutos o metanol en frío durante 3-5 minutos a 4 °C. Tenga en cuenta que, dado que la mayoría de los anticuerpos utilizados en el estudio solo funcionaron con la fijación de PFA, las muestras generalmente se fijaron con PFA al 4% p/v en PBS, a menos que se mencione lo contrario en las leyendas de las figuras. El AFP se descartó de acuerdo con las normas de seguridad y las celdas se lavaron tres veces con PBS. Las células fueron permeabilizadas usando 0.Triton X – 100 al 5% v / v durante 5-7 minutos y lavado tres veces con PBS para eliminar cualquier residuo de detergente. A continuación, se añadió una solución que contenía un 1% p/v de ASC a los cubreobjetos, como solución de bloqueo, para reducir la unión no específica de los anticuerpos primarios y secundarios, y se mantuvo durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se extraía de los cubreobjetos y se añadían los anticuerpos primarios a las diluciones apropiadas en los cubreobjetos. Los cubreobjetos con anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C durante 16-20 horas en una cámara húmeda y húmeda. A continuación, los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con una solución que contenía anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. (Tenga en cuenta que las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios se hicieron en el tampón de bloqueo.) La dilución de los anticuerpos secundarios utilizados para este estudio fue de 1:400 preparada en solución de ASC al 1% p/v. Por último, los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS y agua estéril de alta pureza y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando el medio de montaje DAPI anti-decoloración Pro-Long gold (Invitrogen, EE.UU.). A continuación, se tomaron imágenes de los cubreobjetos utilizando el microscopio confocal Zeiss LSM880 o LSM780 utilizando el objetivo de inmersión en aceite 63x.

Imágenes de células vivas

Se sembraron células ATG16L1-knockout en los platos de MatTek (MatTek, Ashland MA USA). Al día siguiente, estas células fueron transfectadas con plásmido apropiado basado en requisitos experimentales utilizando el reactivo de transfección Mirus Trans-IT 2020. La transfección se realizó con el medio OptiMem, utilizando el protocolo del fabricante. A continuación, se utilizó una solución madre Triton X-100 al 2% para alcanzar la concentración designada para la extracción de detergente de la membrana plasmática. Una concentración final de Tritón X-100 al 1% es capaz de extraer el citosólico y la membrana unida. El experimento para confirmar la presencia de agregados de p62 en células ATG16L1-knockout, sin embargo, involucró la extracción de detergente utilizando Tritón X-100 al 1,5% como concentración final para someter a las células a condiciones de extracción más duras. A continuación, se realizó la obtención de imágenes utilizando el módulo de «Series temporales» en un microscopio Zeiss AxioObserver Z1 incubado con un microscopio confocal LSM780 utilizando una lente de inmersión en aceite Apocromático de plan 63 × 1,4 NA.

Microscopía de superresolución

Las muestras se sembraron en cubreobjetos Zeiss de alta precisión No 1,5 170+ o -5 µm, 18 mm × 18 mm. Después de la tinción, las muestras se montaron en un medio de montaje DAPI anti-decoloración Pro-Long gold (Life Technologies) y se dejaron endurecer durante 3 días para alcanzar un índice de Refracción constante (IR) de 1,46. Se tomaron imágenes de las muestras utilizando Iluminación estructurada en el Elyra PS1 (Microscopía Carl Zeiss). Después de la alineación de etapas, se utilizaron líneas láser de 405, 488 y 561 nm para obtener imágenes de una pila de bolas con el fin de corregir la aberración cromática utilizando el algoritmo de alineación de canales. Las pilas Z se adquirieron en 5 fases y 5 rotaciones de la rejilla de iluminación y posteriormente se procesaron y alinearon utilizando el software ZEN Black Elyra edition (Microscopía Carl Zeiss).

Extracción de fracciones solubles e insolubles

La extracción de fracciones solubles e insolubles de células ATG16L1-knockout se realizó en tampón RIPA. Brevemente, las células se lavaron con 1X PBS heladas una vez y se rasparon, se lisaron en 500 µl de tampón RIPA y se recogieron en tubos etiquetados mantenidos en hielo. La composición del tampón RIPA fue la siguiente:

Tampón RIPA

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mm EDTA

1% Triton X-100

0.5% Desoxicolato de sodio

0.1% de SDS

En el momento del uso, el tampón RIPA se complementó con comprimidos completos de inhibidor de proteasa (1 comprimido por 50 ml) y cócteles de inhibidores de fosfatasa 2 y 3 (1:100 cada uno).

Los lisados se pasaron a través de una aguja de 25 G 10 veces y luego la solución se centrifugó a 14000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se recogió en un tubo de Eppendorf fresco y se etiquetó como la fracción soluble y se mezcló con 300 µl de tampón 2X Laemmli y se hervió durante 5 minutos. El pellet obtenido después de la centrifugación consiste en la fracción insoluble y se resuspendió y lavó con 500 µl de tampón RIPA. La solución resuspendida se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el gránulo en 100 µl de tampón de UREA + RIPA. Esto finalmente se mezcló con 100 µl de 2X tampón Laemmli y se hervió durante 5 minutos. La composición del tampón de UREA + RIPA consiste en urea adicional a una concentración final de 2 M junto con los componentes del tampón de RIPA.

Western blot

Se lisaron células cultivadas en placas de 6 pocillos y se recogieron en 2 tampones Laemmli (4% p/v SDS, 20% v/v glicerol, 10% v/v 2-mercaptoetanol, 0,004% p/v azul de bromofenol y 125 mm Tris HCl, pH 6,8). Después de que las células se lisaron, se cargaron 20-30 µl de las muestras en una página de SDS de 10 pocillos, 12-15% y se ejecutaron a 100-120 V. Se cargó una escalera estándar de M. W. junto con las muestras para mantener un registro del movimiento de las proteínas en el gel. Las proteínas se transfirieron al PVDF activado a 100 V durante 60 minutos. La membrana se retiró al finalizar la transferencia y se empapó en leche desnatada al 5% p/v para bloquear sitios de unión no específicos, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió a la membrana una solución que contenía un anticuerpo primario específico (preparado en leche desnatada al 5% p/v) a una dilución adecuada para incubar durante la noche a 4 °C. Las membranas se lavaron tres veces con PBST (solución salina tampón de fosfato +0,1% Tween-20) antes de la adición de anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario, también preparado en leche desnatada al 5% p/v, se incubó con la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. La dilución del anticuerpo secundario se mantuvo generalmente en 1:4000 para los anticuerpos conjugados con HRP de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y en 1: 5000 para los anticuerpos conjugados con fluoróforos LICOROSOS. Las membranas se lavaron de nuevo con PBST varias veces y se desarrollaron utilizando una mezcla de volúmenes iguales de soluciones de desarrollo 1 y 2 para ECL o se tomaron imágenes directamente para la detección de señales de fluorescencia utilizando el software LICOR Image Studio (LICOR, EE.UU.).

Generación de células eliminatorias CRISPR

Los ARN guía fueron diseñados para la generación de células eliminatorias ATG9 utilizando la herramienta en línea desarrollada por Zhang Lab21. Los tres primeros impactos de ARN de guía única (sgRNA) se modificaron manualmente para agregar sitios de restricción BbsI y estas secuencias de sgRNA de pureza desalada se ordenaron a Invitrogen. La secuencia utilizada con éxito para ATG9 CRISPR knockout fue:

Los nucleótidos resaltados indican los voladizos añadidos. El sgRNA se ligó en la columna vertebral de psCas9-2A-puromicina. Los plásmidos ligados con éxito o el control vectorial Cas9 vacío se transfectaron en células HeLa y la expresión se permitió durante 24 horas. Las células transfectadas se seleccionaron añadiendo puromicina a las células a una concentración final de 2-4 µg / ml. Las células se dejan crecer hasta que todas las células no transfectadas fueron muertos. A continuación, se tripsinizaron las células positivas y se evaluó el número de células utilizando portaobjetos Invitrogen Countess (suspensión celular homogénea de 10 µl +azul tripano de 10 µl). Sobre la base de la población de células vivas, se aspiraron 0,2 × 104 células y se diluyeron en serie en una placa de 96 pocillos para obtener colonias unicelulares. La dilución en serie fue siempre 1:1 y el volumen final en cada pocillo al final de la dilución se mantuvo en 200 µl. Los lisados celulares se cargaron en la PÁGINA SDS, se transfirieron a una membrana para verificar la eliminación de ATG9.

Cuantificación de datos y análisis estadístico

Las imágenes se cuantificaron utilizando el complemento predeterminado ‘Analizar partículas’ en ImageJ. Además, se identificaron los píxeles co-localizados y se generó un perfil utilizando un algoritmo de complemento ImageJ sin supervisión llamado ‘colocalización’, que fue desarrollado por Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, París; 2003–2004). Los western blots se cuantificaron utilizando el software LICOR Image Studio (LICOR, EE. UU.) y los valores se procesaron, analizaron y trazaron utilizando el programa Excel de la suite Microsoft Office.

Los niveles de significación estadística para las comparaciones entre dos grupos se estimaron mediante pruebas t de una o dos colas. Para el experimento con ATG7 y ATG10 KD, se utilizó la prueba t de una cola para evaluar la significación estadística de los datos. Para todos los demás experimentos de este estudio, se utilizó una prueba t de dos colas para evaluar la significación estadística de los datos. En este artículo, el valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo y las convenciones utilizadas para representar los resultados en este artículo son las siguientes: *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001 y las barras de error representan desviaciones estándar a menos que se mencione lo contrario.