LC3-positiiviset rakenteet ovat merkittäviä autofagian puutteellisissa soluissa

Materiaalit

tässä tutkimuksessa käytetyt vasta-aineet ovat: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) ja kaikki Alexa-konjugoidut toissijaiset vasta-aineet ostettiin Invitrogenista. PEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A ja RFP-LC3 konstruktiot olivat ystävällisiä lahjoja tohtori T. Yoshimorilta (Osakan yliopisto, Japani). ATG9A-pEGFP oli ystävällinen lahja tohtori Y. Takahashilta (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry oli Clontechilta (632524), MCHERRY-p62 ja MCHERRY-p62 LIR mutant (DDDW335-338aaaa) oli ystävällinen lahja tohtori Sascha Martensilta (Wienin yliopisto, Itävalta), P62-pEGFP oli ystävällinen lahja Tri. Terje Johansen (Artic University, Norja), kun taas Myc-LC3-G120A-ΔC22 oli lahja tohtori T. Yoshimorilta (Addgene plasmid # 45449). PSpCas9 (BB) – 2a-Puro (PX459) V2.0 oli lahja tohtori F. Zhangilta (Addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 oli ystävällinen lahja tohtori Isei Tanidalta. EGFP-LC3K51A ja EGFP-LC3F52A luotiin site mutagenesis käyttäen Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) ja pEGFP-LC3 mallina valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet, joita käytetään k51a-mutaatiossa: 5 ’- ccgtccgacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ’ ja F52A-mutaatiossa: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

soluviljelmä

HeLa-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle Mediumissa (dmem), johon oli lisätty 10% v/v sikiön naudan seerumia, 100 U/ml penisilliini-streptomysiiniä ja 2 mM L-glutamiinia. HepG2-solut säilytettiin rpmi 1640-liuoksessa, jota täydennettiin 10-prosenttisella v/v sikiön naudan seerumilla, 100 U/ml penisilliini-streptomysiinillä, jotka kaikki oli saatu Sigmasta, Yhdistyneestä kuningaskunnasta. Solulinjoja ylläpidettiin läpäisemällä solut trypsiini-EDTA-liuoksella (Sigma), kun ne ovat T75-pulloissa (75 cm2: n pinta-ala) noin 75-90%: ssa. Tutkimuksessa käytetty solulinja oli HeLa (Human cervical cancer cells) – solulinja. Kokeissa, joissa piti estää autofaginen vuo, soluja käsiteltiin 400 nM: llä bafilomysiini A1: tä 4 tunnin ajan 37 °C: ssa.

Transfektio

HeLa-solut transfektoitiin puhdistetulla plasmidilla Mirus TransIT-2020-transfektioreagenssilla. Transfektio tehtiin optiMEM-mediumilla valmistajan protokollan mukaisesti. Valmisteltiin lyhyesti 100 µl optiMEM-liuosta ja 1 µg DNA: ta sisältävä seos, jota inkuboitiin huoneenlämmössä 5 minuutin ajan. Toinen seos, joka sisältää 100 µl optimemia ja 5 µl Mirusta, valmistettiin ja inkuboitiin 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen molemmat liuokset sekoitettiin toisiinsa ja inkuboitiin noin 20-25 minuuttia. Tämän jälkeen kokonaistilavuus lisättiin yhteen 6-kuoppaisen levyn kaivoon, jossa oli jo 1 ml optiMEM-valmistetta. Verensiirtoon yleensä käytetyn DNA: n määrä oli 1 µg 6-kuoppaan.

siRNA-välitteinen knockdown

siRNA knockdownin solut transfektoitiin lipofektamiini 2000-transfektioreagenssilla. Transfektio tehtiin optiMEM-mediumilla valmistajan protokollan mukaisesti. Valmisteltiin lyhyesti 100 µl optiMEM-seosta, jossa 3 µl on 20 µM tai 1 µl 100 µM siRNA, ja sitä inkuboitiin huoneenlämmössä 5 minuutin ajan. Samanaikaisesti valmistettiin toinen seos, joka sisälsi 100 µl optimemia ja 5 µl Lipofektamiini 2000: ta, ja sitä inkuboitiin 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen molemmat liuokset sekoitettiin toisiinsa ja inkuboitiin noin 20-25 minuuttia. Tämän jälkeen kokonaistilavuus lisättiin yhteen 6-kaivolevyn kaivoon, jossa oli jo 1 ml optiMEM-valmistetta 4 tunnin ajan 37 °C: ssa. Inkubaation jälkeen mediaa muutettiin ja korvattiin täysmedialla. Solut kerättiin talteen 48 tunnin inkubaation jälkeen, jos haluttiin yksi knockdown (KD), kuten HeLa-soluissa ATG7 ja ATG10 KD. Atg7-ja ATG10-pelastuskokeita varten pcDNA.3 (tyhjä vektori) tai ATG7 plus ATG10-lippu käytettiin siirtää soluja 24 tuntia siRNA transfektion jälkeen. Kaksois-KD-tutkimuksissa teimme toisen siRNA-transfektiokierroksen edellä mainitun protokollan mukaisesti ensimmäisen kierroksen jälkeen (P62 KD-tutkimuksissa). HepG2-soluissa tapahtuvaa sirnan knockdownia varten nämä transfektoitiin Lipofektamiini RNAi max-transfektioreagenssilla käyttäen 100 nM: n lopullista sirnaa ja kaksi siRNA-transfektiokierrosta suoritettiin tehokkaan knockdownin aikaansaamiseksi. Tämän jälkeen solut halkaistiin ja kylvettiin vastaaviin levyihin tai peitinkappaleisiin lisäkokeita varten. Salattu siRNA (ON-TARGETplus Non-targeting Pool, d-001810-10), human ON-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), ihmisen on-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), ihmisen on-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) tilattiin dharmaconilta ja niitä käytettiin lopullisena pitoisuutena 50-100 nM.

GFP-trap-määritykset

HeLa-solut transfektoitiin EGFP-LC3: lla käyttäen Mirus TransIT-2020-transfektioreagenssia ja 24 tuntia myöhemmin Lysis-puskurissa (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) 10 min jäällä ja pelletoidaan 10 min nopeudella 13 000 rpm. GFP-merkityt proteiinit (EGFP tai EGFP-LC3) vedettiin alas GFP-ANSAHELMILLÄ (ChromoTek) valmistajan protokollan mukaan. Immunopresipitaatit eluoitiin keittämällä näytteitä Laemmli-puskurissa 5 minuutin ajan. Proteiinit ratkaistiin SDS-sivulla.

immunofluoresenssi

immunosytokemia suoritettiin 22 × 22 mm: n peittävissä soluissa kasvatetuille soluille. HeLa-soluja kasvatettiin 70-80%: n konfluenssilla, pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin sen jälkeen joko 4% w/v PFA: lla 5-7 minuutin ajan tai kylmämetanolilla 3-5 minuutin ajan 4 °C: n lämpötilassa.huomaa, että koska useimmat tutkimuksessa käytetyt vasta-aineet toimivat vain PFA: n kiinnittymisen jälkeen, näytteisiin kiinnitettiin yleensä 4% w/v PFA PBS: ssä, ellei kuviolauselmissa toisin mainita. PFA hävitettiin turvallisuusmääräysten mukaisesti ja solut pestiin kolmesti PBS: llä. Tämän jälkeen solut permeabiloitiin 0: lla.5% v / v Triton X-100 5-7 minuuttia ja pestään kolme kertaa PBS: llä mahdollisen pesuaineen poistamiseksi. Tämän jälkeen peitetyynyyn lisättiin 1% w/v BSA: ta sisältävä liuos estoliuoksena primaaristen ja sekundaaristen vasta-aineiden epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi ja sitä pidettiin 1 tunti huoneenlämmössä. Tämän jälkeen estoliuos naputettiin pois peitelevyistä ja primaariset vasta-aineet lisättiin sopivilla laimennuksilla peitelevyihin. Primaarisia vasta-aineita sisältäviä coverslipiä inkuboitiin 4 °C: ssa 16-20 tuntia kosteassa ja kosteassa kammiossa. Seuraavaksi coverslips pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin sekundaarisia vasta-aineita sisältävällä liuoksella 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. (Huomaa, että primaariset ja sekundaariset vasta-aineliuokset tehtiin estopuskurissa.) Tässä tutkimuksessa käytettyjen sekundaaristen vasta-aineiden laimennus oli 1:400, joka valmistettiin 1% w/v BSA-liuoksessa. Lopuksi coverslips pestiin kahdesti PBS: llä ja erittäin puhtaalla steriilillä vedellä ja asennettiin lasilevyihin Pro-Long gold Anti-fade Dapi-kiinnitysalustalla (Invitrogen, US). Tämän jälkeen coverslips kuvattiin Zeiss LSM880-tai lsm780-konfokaalimikroskoopilla käyttäen 63X-öljykylpytavoitetta.

elävien solujen kuvantaminen

ATG16L1-tyrmäyssolut kylvettiin MatTek-astioihin (MatTek, Ashland MA USA). Seuraavana päivänä nämä solut transfektoitiin asianmukaisella plasmidilla, joka perustui kokeellisiin vaatimuksiin Mirus Trans-IT 2020-transfektioreagenssilla. Transfektio tehtiin optiMEM-mediumilla valmistajan protokollan mukaisesti. Tämän jälkeen käytettiin 2-prosenttista Triton X-100-Kantaliuosta plasmakalvon pesuainepitoisuuden saavuttamiseksi. 1%: n Triton X-100-loppupitoisuus kykenee erottamaan sytosolisen ja kalvosidoksen. Kokeessa, jossa vahvistettiin P62-aggregaattien esiintyminen atg16l1-tyrmäyssoluissa, käytettiin kuitenkin pesuaineen uuttoa käyttäen 1,5-prosenttista Triton X-100: aa lopullisena pitoisuutena, jolla solut altistettiin kovemmille uutto-olosuhteille. Tämän jälkeen kuvantaminen suoritettiin aikasarja-moduulilla inkuboidulla Zeiss AxioObserver Z1-mikroskoopilla lsm780-konfokaalimikroskoopilla käyttäen 63 × 1,4 NA Plan Apochromat-öljykylpylinssiä.

superresoluutiomikroskopia

näytteet kylvettiin Zeissin korkean tarkkuuden nro 1, 5 170+ tai -5 µm, 18 mm × 18 mm coverslipsiin. Värjäyksen jälkeen näytteet asennettiin Pro-Long gold Anti-fade Dapi-kiinnitysväliaineeseen (Life Technologies) ja niiden annettiin kovettua 3 päivää jatkuvan taitekertoimen (ri) saavuttamiseksi 1,46: een. Näytteet kuvattiin rakenteellisella valaistuksella Elyra PS1: llä (Carl Zeiss Microscopy). Vaiheen linjauksen jälkeen helmipinon kuvaamiseen käytettiin 405, 488 ja 561 nm: n laserviivoja kromaattisen aberraation korjaamiseksi kanavan linjausalgoritmin avulla. Z-Pinot hankittiin 5-vaiheisina ja 5-pyörimisinä valaistusruudukossa, minkä jälkeen ne jalostettiin ja kohdistettiin Zen Black Elyra edition-ohjelmistolla (Carl Zeiss Microscopy).

liukenevien ja liukenemattomien fraktioiden uuttaminen

liukenevien ja liukenemattomien fraktioiden uuttaminen ATG16L1-knockout-soluista suoritettiin RIPA-puskurissa. Kennot pestiin lyhyesti kerran 1x jääkylmällä PBS: llä ja ne kaavittiin, lysättiin 500 µl RIPA-puskuriin ja kerättiin jäässä pidettyihin merkittyihin putkiin. RIPA-puskurin koostumus oli seuraava –

RIPA-puskuri

50 mM Tris-HCl (pH 7, 4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Natriumdeoksikolaatti

0.1% SDS

käyttöajankohtana RIPA-puskuria täydennettiin täydellisillä proteaasinestäjätableteilla (1 tabletti / 50 ml) ja fosfataasinestäjäsekoituksilla 2 ja 3 (1:100 kukin).

lysaatit johdettiin sitten 25 G: n neulan läpi 10 kertaa, minkä jälkeen liuosta sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 15 minuutin ajan 4 °C: ssa.sentrifugoinnin jälkeen supernatantti kerättiin tuoreeseen Eppendorf-putkeen ja merkittiin liukoiseksi fraktioksi, sekoitettiin 300 µl: aan 2x Laemmli-puskuria ja keitettiin 5 minuutin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen saatu sakka koostuu liukenemattomasta fraktiosta, joka suspendoitiin uudelleen ja pestiin 500 µl RIPA-puskurilla. Uudelleen suspendoitua liuosta sentrifugoitiin sitten nopeudella 14000 rpm 5 minuutin ajan 4 °C: ssa.supernatantti hylättiin ja sakka suspendoitiin uudelleen 100 µl: aan UREA + RIPA-puskuria. Tähän sekoitettiin lopulta 100 µl 2X Laemmli-puskuria ja sitä keitettiin 5 minuuttia. UREA + RIPA-puskurin koostumus koostuu ylimääräisestä ureasta, jonka lopullinen pitoisuus on 2 M, yhdessä RIPA-puskurin komponenttien kanssa.

Western blot

6-kuoppalevyillä viljellyt solut lysättiin ja kerättiin 2X laemmli-puskuriin (4% w/v SDS, 20% v/v glyseroli, 10% v/v 2-merkaptoetanoli, 0, 004% w/v bromifenolisininen ja 125 mM Tris HCl, pH 6, 8). Solujen lysähdyksen jälkeen 20-30 µl näytettä kuormitettiin 10-kuoppaan, 12-15% SDS-sivulle ja ajettiin 100-120 V: lla.näytteiden mukana ladattiin M. W.: n vakiotikkaat, jotta geelissä olevien proteiinien liikkeitä voitiin seurata. Proteiinit siirrettiin aktivoituun PVDF: ään 100 V: n nopeudella 60 minuutin ajan. Kalvo poistettiin siirron jälkeen, ja sitä liotettiin 5% w/v rasvatussa maidossa epäspesifisten sitomiskohtien tukkimiseksi 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Seuraavaksi kalvoon lisättiin sopivassa laimennuksessa spesifistä primaarista vasta-ainetta sisältävä liuos (valmistettu 5% w/v rasvatussa maidossa) yön yli tapahtuvaa inkubaatiota varten 4 °C: ssa.kalvot pestiin sitten kolme kertaa PBST: llä (fosfaattipuskuriliuos +0, 1% Tween-20) ennen sekundaarisen vasta-aineen lisäämistä. Sekundaarista vasta-ainetta, joka myös valmistettiin 5% w/v rasvatussa maidossa, inkuboitiin kalvolla 1 tunti huoneenlämmössä. Sekundaarisen vasta-aineen laimennoksena pidettiin yleensä 1:4000 tehostetun kemiluminesenssin (ECL) HRP-konjugoituneiden vasta-aineiden osalta ja 1:5000 licor-fluoriforikonjugoituneiden vasta-aineiden osalta. Kalvot pestiin uudelleen pbst: llä useita kertoja, ja ne kehitettiin käyttämällä yhtä suuria määriä ECL: ään kehitettyjä ratkaisuja 1 ja 2 tai kuvattiin suoraan fluoresenssisignaalin havaitsemiseen LICOR Image Studio Softwaren (licor, US) avulla.

CRISPR knockout cell generation

the guide RNAs suunniteltiin Atg9 knockout cell-sukupolven tuottamiseen Zhang Lab21: n kehittämän verkkotyökalun avulla. Top kolme yhden oppaan RNA (sgRNA) osumia muokattiin manuaalisesti lisätä BbsI rajoitus sivustoja ja nämä sgRNA sekvenssit suolattoman puhtauden tilattiin Invitrogen. Atg9 CRISPR knockoutille onnistuneesti käytetty sekvenssi oli:

korostetut nukleotidit kertovat lisätyistä ulokkeista. SgRNA liitettiin psCas9-2A-puromysiinin selkärankaan. Onnistuneesti ligoidut plasmidit tai tyhjät Cas9-vektoriohjaukset transfektoitiin HeLa-soluissa ja ilmentyminen sallittiin 24 tunnin ajan. Transfektoidut solut valittiin sitten lisäämällä soluihin puromysiiniä lopullisena pitoisuutena 2-4 µg / ml. Solujen annettiin kasvaa, kunnes kaikki siirtämättä jääneet solut olivat kuolleet. Tämän jälkeen positiiviset solut trypsinoitiin ja solujen lukumäärä arvioitiin Invitrogen Countess-dioilla (10 µl homogeenista solususpensiota +10 µl Trypansinistä). Elävän solupopulaation perusteella 0,2 × 104 solua aspiroitiin ja laimennettiin sarjamaisesti 96-kuoppalevylle, jotta saatiin yksittäisiä solupesäkkeitä. Sarjadilimaatio oli aina 1:1 ja kunkin kaivon lopullinen tilavuus laimennuksen lopussa pidettiin 200 µl: aan. Solulysaatit ladattiin SDS-sivulle, siirrettiin kalvolle atg9: n tyrmäyksen varalta.

tietojen kvantifiointi ja tilastollinen analyysi

kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ: n oletusliitännäistä ”Analysis partikkelit”. Lisäksi tunnistettiin rinnakkaispaikalliset Pikselit ja luotiin profiili käyttäen valvomatonta ImageJ-lisäalgoritmia nimeltä ”colocalization”, jonka kehitti Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). Western blots kvantifioitiin käyttäen LICOR Image Studio-ohjelmistoa (licor, US) ja arvot käsiteltiin, analysoitiin ja piirrettiin Microsoft Office-ohjelmiston Excel-ohjelmalla.

kahden ryhmän välisen vertailun tilastollinen merkitsevyystaso arvioitiin yksi-tai kaksihäntäisellä t-testillä. Kokeessa, jossa käytettiin ATG7: ää ja ATG10 KD: tä, käytettiin yksihäntäistä t-testiä tulosten tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseksi. Kaikkien tämän tutkimuksen muiden kokeiden tilastollista merkitsevyyttä arvioitiin kaksipyrstöisellä t-testillä. Tässä asiakirjassa P < 0, 05: n arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä, ja tulosten kuvaamiseen käytetyt käytännöt tässä artikkelissa ovat seuraavat: *p ≤ 0, 05; **p ≤ 0, 01; ***p ≤ 0, 001 ja Virhepalkit edustavat keskihajontaa, ellei toisin mainita.