Calmoduline
Interactions de la calmoduline avec Ca2+ et avec NOS
CaM est une petite protéine de liaison au Ca2+ (poids moléculaire 17 kDa) constituée de deux lobes globulaires similaires reliés par une région centrale de liaison. Chaque lobe contient deux aiguilles E-F qui comprennent une hélice N-terminale (hélice E), une boucle de coordination Ca2 + située au centre et une hélice C-terminale (hélice F) (les domaines de CaM sont généralement étiquetés comme 1-4 de N à C terminal). Lors de la liaison au Ca2+, CaM est capable de se lier et d’activer plus de 30 enzymes cibles, ce qui lui permet de réguler de nombreux seconds messagers et fonctions cellulaires. La liaison et l’activation complète des protéines cibles par la CaM nécessitent généralement l’occupation des quatre sites de liaison au Ca2+ dans la CaM. Le lobe carboxy-terminal contient deux sites de liaison au Ca2+ à haute affinité, tandis que le lobe amino-terminal contient deux sites avec une affinité Ca2 + plus faible. Des changements conformationnels se produisent dans CaM après qu’il lie Ca2+: les résidus de surface hydrophobes sont exposés afin de former des interactions cruciales de van der Waals avec la face hydrophobe du site de reconnaissance du peptide cible.
CaM se lie à chaque sous-unité NOS dans une stœchiométrie 1: 1 avec une affinité raisonnablement élevée. Des études d’affinité de liaison avec des peptides qui correspondent à des séquences de reconnaissance de NOS CAM montrent que les trois NOS présentent des affinités différentes avec la CaM, l’ordre général étant NOS inductibles par cytokines (iNOS) ≫ NOS neuronaux (nNos) ≈ NOS endothéliaux (eNOS). Le peptide iNOS se lie bien à la CaM à la fois en présence et en absence de Ca2+, mais les peptides eNOS et nNos ne se lient à la CaM qu’en présence de Ca2+.
Chaque lobe de CAM se lie à NOS indépendamment et présente des affinités différentes avec NOS. L’interaction CaM–nNos a été étudiée à l’aide de mutants CaM et de protéines CaM végétales. Le nNos présente un haut degré de spécificité structurelle vis-à-vis des domaines CaM 1, 3 et éventuellement 4 en ce qui concerne l’activation de la réduction de l’hème et de la synthèse NO. Les interactions CaM–nNos sont particulièrement importantes pour le transfert d’électrons et impliquent la région de verrouillage de CaM (formée par les domaines CaM 1 et 3) et un résidu de méthionine dans le domaine 4. Ces régions de CaM semblent interagir avec des régions encore inconnues sur les NNO qui sont distinctes de sa séquence canonique de liaison à CaM. La charge et la longueur du lieur central affectent également la liaison et l’activation des iNOS par l’interaction électrostatique dans le lieur central et les interactions hydrophobes dans le domaine globulaire de la CaM, ce qui semble responsable de son association étroite avec les iNOS. La dissociation du Ca2 + de la CaM liée à NOS se produit en deux étapes séquentielles: une dissociation rapide du Ca2 + du lobe N-terminal se produit en premier et correspond à l’inactivation de la synthèse du NO, suivie d’une dissociation plus lente du Ca2 + du lobe C-terminal, ce qui conduit à la dissociation du CaM de NOS. Des changements conformationnels se produisent dans les peptides de liaison à la CAM NOS lorsqu’ils se lient à la CaM. Typiquement, les peptides acquièrent une conformation α-hélicoïdale lors de l’interaction avec la CaM liée au Ca2+. Un changement conformationnel induit par la CaM dans le domaine de la NOS réductase se produit également comme indiqué par des changements dans la fluorescence des protéines et des flavines et par un changement dans le schéma de protéolyse de la trypsine.
Une structure cristallographique de CaM chargé en Ca2+ lié à un peptide à 20 résidus correspondant à la séquence de reconnaissance de CAM eNOS est disponible. La structure a révélé que le peptide ENOS α-hélicoïdal se lie à la CaM dans une orientation antiparallèle par le biais d’interactions hydrophobes étendues: les lobes N-terminaux et C-terminaux de la CaM s’enroulent autour du peptide lié, interagissant avec les moitiés C- et N-terminales du peptide, respectivement. Des résidus CaM spécifiques dans la région de verrouillage et le domaine 4 ont été positionnés d’une manière compatible avec leur importance telle que déterminée par des études de mutagenèse. La structure cristalline a également suggéré une base pour une liaison CAM plus serrée dans les iNOS: étant donné que l’iNOS contient un plus grand nombre de résidus hydrophobes dans sa séquence de reconnaissance CaM correspondante, il a été avancé que ceux-ci soutiendraient des contacts plus étendus de van der Waals avec la CaM et minimiseraient l’exposition défavorable aux solvants des résidus hydrophobes afin de favoriser une association plus étroite entre la CaM et la séquence de reconnaissance iNOS CaM.
La structure cristalline d’un complexe entre Ca2+/CaM et le domaine FMN des iNOS humains est également disponible. Quatre conformations différentes ont été identifiées dans la structure du complexe, ce qui démontre la nature flexible des interactions CaM et FMN domaine–domaine. Un pont de sel formé entre la CAME et le domaine FMN est apparent dans la structure et peut être important pour transduire l’effet de la liaison de la CAME sur les fonctions NOS.