Les structures positives à la LC3 sont importantes dans les cellules déficientes en autophagie

Matériaux

Les anticorps utilisés dans cette étude sont: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) et tous les anticorps secondaires conjugués à Alexa ont été achetés auprès d’Invitrogen. Les constructions pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A et RFP-LC3 étaient des cadeaux aimables du Dr T. Yoshimori (Université d’Osaka, Japon). ATG9A-pEGFP était un cadeau aimable du Dr Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry était de Clontech (632524), mCherry-p62 et mCherry-p62 Mutant LIR (DDDW335-338AAAA) était un cadeau aimable du Dr Sascha Martens (Université de Vienne, Autriche), p62-pEGFP était un cadeau aimable du Dr. Terje Johansen (Université Artic, Norvège), tandis que Myc-LC3-G120A-ΔC22 était un cadeau du Dr T. Yoshimori (plasmide Addgène #45449). Le pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 était un cadeau du Dr F. Zhang (plasmide Addgène #62988). pCMV-ATG7 était un cadeau aimable du Dr Isei Tanida. EGFP-LC3K51A et EGFP-LC3F52A ont été créés par mutagenèse sur site en utilisant le kit de mutagenèse dirigée sur site Q5 (NEB E0554S) et le pEGFP-LC3 comme modèle conformément aux instructions du fabricant. Amorces utilisées pour la mutation K51A : 5′-ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3′ et pour la mutation F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Culture cellulaire

Les cellules HeLa ont été cultivées dans le Milieu Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco additionné de sérum fœtal bovin à 10% v/v, de 100 U/ml de pénicilline-streptomycine et de 2 mM de L-glutamine. Les cellules HepG2 ont été maintenues dans un milieu RPMI 1640 additionné de sérum fœtal bovin à 10% v/v, 100 U/ml de pénicilline-streptomycine, toutes obtenues auprès de Sigma, Royaume-Uni. Les lignées cellulaires ont été maintenues en faisant passer les cellules, en utilisant une solution de Trypsine-EDTA (Sigma), après qu’elles soient sous-confluentes à environ 75-90% dans des flacons de T75 (75 cm2 de surface) (Falcon). La lignée cellulaire utilisée pour cette étude était la lignée cellulaire HeLa (Human cervical cancer cells). Dans les expériences où nous devions bloquer le flux autophagique, les cellules ont été traitées avec 400 nM de bafilomycine A1 pendant 4 heures à 37 ° C.

Transfection

Les cellules HeLa ont été transfectées avec le plasmide purifié en utilisant le réactif de transfection Mirus TransIT-2020. La transfection a été réalisée en utilisant le milieu optiMEM, selon le protocole du fabricant. Brièvement, un mélange de 100 µl d’optiMEM avec 1 µg d’ADN a été préparé et incubé à température ambiante pendant 5 minutes. Un autre mélange contenant 100 µl optiMEM avec 5 µl de Mirus a été préparé et incubé pendant 5 minutes. Les deux solutions ont ensuite été mélangées et incubées pendant environ 20 à 25 minutes. Le volume total a ensuite été ajouté à un puits d’une plaque à 6 puits, contenant déjà 1 ml d’optiMEM. La quantité d’ADN généralement utilisée pour la transfection était de 1 µg pour un 6 puits.

Knockdown médié par l’ARNsi

Les cellules pour le knockdown de l’ARNsi ont été transfectées à l’aide du réactif de transfection lipofectamine 2000. La transfection a été réalisée en utilisant le milieu optiMEM, selon le protocole du fabricant. Brièvement, un mélange de 100 µl d’optiMEM avec 3 µl de siRNA de 20 µM ou 1 µl de siRNA de 100 µM a été préparé et incubé à température ambiante pendant 5 minutes. Simultanément, un autre mélange contenant 100 µl optiMEM avec 5 µl de Lipofectamine 2000 a été préparé et incubé pendant 5 minutes. Les deux solutions ont ensuite été mélangées et incubées pendant environ 20 à 25 minutes. Le volume total a ensuite été ajouté à un puits d’une plaque à 6 puits, contenant déjà 1 ml d’optiMEM pendant 4 heures à 37 °C. Après l’incubation, le support a été changé et remplacé par un support complet. Les cellules ont ensuite été récoltées après 48 heures d’incubation si un seul knockdown (KD) était souhaité, comme pour les KD ATG7 et ATG10 dans les cellules HeLa. Pour les expériences de sauvetage ATG7 et ATG10, un adNPC.3 (vecteur vide) ou ATG7 plus l’INDICATEUR ATG10 ont été utilisés pour transfecter les cellules 24 heures après la transfection de l’ARNsi. Pour les études de double KD, nous avons effectué un autre cycle de transfection d’ARNsi, suivant le même protocole que mentionné ci-dessus, après le premier cycle (pour les études de KD p62). Pour le knockdown de l’ARNsi dans les cellules HepG2, celles-ci ont été transfectées à l’aide du réactif de transfection RNAi max de la lipofectamine à l’aide d’un ARNsi final de 100 nM et deux séries de transfection d’ARNsi ont été effectuées pour obtenir un knockdown efficace. Les cellules ont ensuite été divisées et ensemencées sur des plaques ou des lamelles respectives pour d’autres expériences. Le siRNA brouillé (Pool Non ciblé SUR TARGETplus, D-001810-10), humain SUR TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005 ), humain SUR-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), humain SUR-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) ont été commandés à Dharmacon et utilisés à une concentration finale de 50 à 100 nM.

GFP-trap tests

Les cellules HeLa ont été transfectées avec EGFP-LC3 en utilisant le réactif de transfection Mirus TransIT-2020 et 24 heures plus tard ont été lysées dans du tampon de lyse (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 à 1%, 1.5 mm MgCl2, 5 mm EGTA) pendant 10 min sur glace et granulé pendant 10 min à 13 000 tr/min. Les protéines marquées au GFP (EGFP ou EGFP-LC3) ont été tirées vers le bas à l’aide de billes de piège à GFP (ChromoTek), selon le protocole du fabricant. Les immunoprécipités ont été élués en faisant bouillir les échantillons dans du tampon Laemmli pendant 5 min. Les protéines ont été résolues par SDS-PAGE.

Immunofluorescence

L’immunocytochimie a été réalisée sur des cellules cultivées sur des lamelles de couverture de 22 × 22 mm. Les cellules HeLa ont été cultivées à une confluence de 70-80%, lavées une fois avec du PBS, puis fixées à l’aide de PFA à 4% p / v pendant 5-7 minutes ou de méthanol à froid pendant 3-5 minutes à 4 ° C. Veuillez noter que la plupart des anticorps utilisés dans l’étude ne fonctionnaient que lors de la fixation du PFA, les échantillons étaient généralement fixés avec du PFA à 4% p / v dans le PBS, sauf mention contraire dans la légende de la figure. Le PFA a été jeté conformément aux règles de sécurité et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Les cellules ont ensuite été perméabilisées à l’aide de 0.5% v / v Triton X-100 pendant 5 à 7 minutes et lavé trois fois avec du PBS pour éliminer tout détergent résiduel. Une solution contenant 1% p/v de BSA a ensuite été ajoutée sur les lamelles, comme solution de blocage, pour réduire la liaison non spécifique des anticorps primaires et secondaires, et conservée pendant 1 heure à température ambiante. La solution de blocage a ensuite été prélevée sur les lamelles et les anticorps primaires aux dilutions appropriées ont été ajoutés sur les lamelles. Les lamelles avec des anticorps primaires ont été incubées à 4 °C pendant 16-20 heures dans une chambre humide et humide. Les lamelles sont ensuite lavées trois fois avec du PBS et incubées avec une solution contenant des anticorps secondaires pendant 1 heure à température ambiante. (Notez que les solutions d’anticorps primaires et secondaires ont été faites dans le tampon de blocage.) La dilution des anticorps secondaires utilisés pour cette étude était de 1:400 préparée dans une solution de BSA à 1% p/v. Enfin, les lamelles ont été lavées deux fois avec du PBS et de l’eau stérile de haute pureté et montées sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage DAPI anti-décoloration Pro-Long gold (Invitrogen, États-Unis). Les lamelles ont ensuite été imagées à l’aide du microscope confocal Zeiss LSM880 ou LSM780 à l’aide de l’objectif à immersion dans l’huile 63x.

Imagerie de cellules vivantes

Les cellules à élimination directe ATG16L1 ont été ensemencées sur les boîtes de MatTek (MatTek, Ashland MA USA). Le lendemain, ces cellules ont été transfectées avec un plasmide approprié sur la base des exigences expérimentales à l’aide du réactif de transfection Mirus Trans-IT 2020. La transfection a été réalisée en utilisant le milieu optiMEM, selon le protocole du fabricant. Une solution mère de Triton X-100 à 2% a ensuite été utilisée pour atteindre la concentration indiquée pour l’extraction détergente de la membrane plasmique. Une concentration finale de 1% de Triton X-100 est capable d’extraire la liaison cytosolique et membranaire. Cependant, l’expérience visant à confirmer la présence d’agrégats p62 dans les cellules à élimination directe ATG16L1 a impliqué une extraction par détergent en utilisant 1,5% de Triton X-100 comme concentration finale pour soumettre les cellules à des conditions d’extraction plus difficiles. L’imagerie a ensuite été réalisée à l’aide du module « Séries chronologiques » sur un microscope Zeiss AxioObserver Z1 incubé avec un microscope confocal LSM780 utilisant une lentille à immersion dans l’huile Apochromat de plan 63 × 1,4 NA.

Microscopie à super-résolution

Les échantillons ont été ensemencés sur des lamelles Zeiss de haute précision No 1,5 170+ ou -5 µm, de 18 mm × 18 mm. Après coloration, les échantillons ont été montés dans un support de montage DAPI anti-décoloration Pro-Long gold (Life Technologies) et laissés durcir pendant 3 jours pour atteindre un indice de Réfraction (RI) constant de 1,46. Des échantillons ont été imagés à l’aide d’un éclairage structuré sur l’Elyra PS1 (Microscopie Carl Zeiss). Après l’alignement des étages, des lignes laser de 405, 488 et 561 nm ont été utilisées pour imager un empilement de billes afin de corriger l’aberration chromatique à l’aide de l’algorithme d’alignement des canaux. Les piles Z ont été acquises en 5 phases et 5 rotations de la grille d’éclairage, puis traitées et alignées à l’aide du logiciel ZEN Black Elyra edition (microscopie Carl Zeiss).

Extraction des fractions solubles et insolubles

L’extraction des fractions solubles et insolubles des cellules knockout ATG16L1 a été réalisée dans du tampon RIPA. Brièvement, les cellules ont été lavées avec 1X de PBS glacé une fois et ont été grattées, lysées dans 500 µl de tampon RIPA et collectées dans des tubes marqués conservés sur de la glace. La composition du tampon RIPA était la suivante:

Tampon RIPA

50 mm Tris-HCl (pH 7,4)

150 mm NaCl

5 mm EDTA

1% Triton X-100

0.5% Désoxycholate de sodium

0.1% de FDS

Au moment de l’utilisation, le tampon RIPA a été complété par un comprimé inhibiteur complet de protéase (1 comprimé par 50 ml) et des cocktails inhibiteurs de phosphatase 2 et 3 (1: 100 chacun).

Les lysats sont ensuite passés à travers une aiguille de 25 G 10 fois puis la solution est centrifugée à 14000 tr/min pendant 15 minutes à 4 °C. Après centrifugation, le surnageant est recueilli dans un tube Eppendorf frais et marqué comme fraction soluble et est mélangé à 300 µl de tampon 2X Laemmli et bouilli pendant 5 minutes. Le culot obtenu après centrifugation est constitué de la fraction insoluble et a été remis en suspension et lavé avec 500 µl de tampon RIPA. La solution remise en suspension est ensuite centrifugée à 14000 tr/min pendant 5 minutes à 4 °C. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans 100 µl de tampon URÉE + RIPA. Celui-ci a finalement été mélangé avec 100 µl de tampon 2X Laemmli et a été bouilli pendant 5 minutes. La composition du tampon URÉE + RIPA est constituée d’urée supplémentaire à une concentration finale de 2 M avec les composants du tampon RIPA.

Western blot

Des cellules cultivées dans des plaques à 6 puits ont été lysées et collectées dans du tampon 2X Laemmli (4% p/ v SDS, 20% v / v glycérol, 10% v / v 2-mercaptoéthanol, 0,004% p/ v bleu de bromophénol et 125 mm Tris HCl, pH 6,8). Une fois les cellules lysées, 20 à 30 µl des échantillons ont été chargés sur une PAGE SDS à 10 puits de 12 à 15% et exécutés à 100-120 V. Une échelle M.W. standard a été chargée avec les échantillons pour suivre le mouvement des protéines dans le gel. Les protéines ont ensuite été transférées sur le PVDF activé à 100 V pendant 60 minutes. La membrane a été retirée à la fin du transfert et a été trempée dans du lait écrémé à 5% p / v pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, une solution contenant un anticorps primaire spécifique (préparé dans du lait écrémé à 5% p/v) à une dilution appropriée a été ajoutée sur la membrane pour une incubation nocturne à 4 °C. Les membranes ont ensuite été lavées trois fois avec du PBST (tampon Phosphate salin + 0,1% Tween-20) avant l’ajout d’anticorps secondaire. L’anticorps secondaire, également préparé dans du lait écrémé à 5% p/v, a été incubé avec la membrane pendant 1 heure à température ambiante. La dilution de l’anticorps secondaire a généralement été maintenue à 1:4000 pour les anticorps conjugués à la chimioluminescence améliorée (ECL) HRP et à 1:5000 pour les anticorps conjugués au fluorophore de RÉGLISSE. Les membranes ont ensuite été lavées à nouveau avec du PBST plusieurs fois et développées en utilisant un mélange de volumes égaux de solutions développantes 1 et 2 pour ECL ou imagées directement pour la détection de signal de fluorescence à l’aide du logiciel LICOR Image Studio (LICOR, US).

Génération de cellules knockout CRISPR

Les ARN guides ont été conçus pour la génération de cellules knockout ATG9 à l’aide de l’outil en ligne développé par le Zhang Lab21. Les trois premiers coups d’ARN guide unique (ARNSGRN) ont été modifiés manuellement pour ajouter des sites de restriction BbsI et ces séquences d’ARNSGRN de pureté dessalée ont été ordonnées à partir d’Invitrogen. La séquence utilisée avec succès pour ATG9 CRISPR knockout était:

La surbrillance des nucléotides indiquer l’ajout des surplombs. Le sgRNA a ensuite été ligaturé dans le squelette psCas9-2A-puromycine. Les plasmides ligaturés avec succès ou le contrôle vectoriel Cas9 vide ont ensuite été transfectés dans des cellules HeLa et l’expression a été autorisée pendant 24 heures. Les cellules transfectées ont ensuite été sélectionnées en ajoutant de la puromycine aux cellules à une concentration finale de 2 à 4 µg/ml. Les cellules ont été autorisées à croître jusqu’à ce que toutes les cellules non transfectées soient mortes. Les cellules positives ont ensuite été trypsinisées et le nombre de cellules a été évalué à l’aide de lames Invitrogen Countess (suspension cellulaire homogène de 10 µl + bleu de Trypan de 10 µl). Sur la base de la population de cellules vivantes, 0,2 × 104 cellules ont été aspirées et diluées en série dans une plaque à 96 puits pour obtenir des colonies unicellulaires. La dilution en série était toujours de 1:1 et le volume final dans chaque puits en fin de dilution a été maintenu à 200 µl. Les lysats cellulaires ont ensuite été chargés sur la PAGE SDS, transférés sur une membrane pour vérifier l’élimination de l’ATG9.

Quantification des données et analyse statistique

Les images ont été quantifiées à l’aide du plugin par défaut « Analyser les particules » dans ImageJ. De plus, les pixels co-localisés ont été identifiés et un profil a été généré à l’aide d’un algorithme de plugin ImageJ non supervisé appelé « colocalisation », développé par Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). Les western blots ont été quantifiés à l’aide du logiciel LICOR Image Studio (LICOR, États-Unis) et les valeurs ont été traitées, analysées et tracées à l’aide du programme Excel de la suite Microsoft Office.

Les niveaux de signification statistique pour les comparaisons entre deux groupes ont été estimés à l’aide de tests t à une ou deux queues. Pour l’expérience impliquant ATG7 et ATG10 KD, un test t à une queue a été utilisé pour évaluer la signification statistique des données. Pour toutes les autres expériences de cette étude, un test t à deux queues a été utilisé pour évaluer la signification statistique des données. Dans cet article, la valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative et les conventions utilisées pour représenter les résultats dans cet article sont les suivantes: *p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 et les barres d’erreur représentent des écarts types, sauf mention contraire.