Le strutture LC3-positive sono prominenti nelle cellule autofagiche carenti

Materiali

Gli anticorpi utilizzati in questo studio sono: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) e tutti gli anticorpi secondari coniugati con Alexa sono stati acquistati da Invitrogen. I costrutti pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A e RFP-LC3 erano regali gentili dal Dr. T. Yoshimori (Università di Osaka, Giappone). ATG9A-pEGFP è stato un gentile regalo del Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry era di Clontech (632524), mCherry-p62 e mCherry-p62 LIR mutant (DDDW335-338AAAA) era un gentile regalo del Dr. Sascha Martens (Università di Vienna, Austria), p62-pEGFP era un gentile regalo del Dr. Terje Johansen (Artic University, Norvegia), mentre Myc-LC3-G120A-ΔC22 è stato un dono del Dr. T. Yoshimori (plasmide Addgene # 45449). Il pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 è stato un regalo dal Dr. F. Zhang (plasmide Addgene # 62988). pCMV-ATG7 è stato un regalo gentile dal Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A e EGFP-LC3F52A sono stati creati da site mutagenesis utilizzando il kit di mutagenesi diretto al sito Q5 (NEB E0554S) e pEGFP-LC3 come modello secondo le istruzioni del produttore. Primer utilizzati per la mutazione K51A: 5 ‘- ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ‘ e per la mutazione F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Coltura cellulare

Le cellule HeLa sono state coltivate nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con siero bovino fetale 10% v/v, 100 U/ml penicillina-streptomicina e 2 mM L-glutammina. Le cellule HepG2 sono state mantenute nel mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale 10% v/v, 100 U / ml penicillina-streptomicina, tutti ottenuti da Sigma, Regno Unito. Le linee cellulari sono state mantenute passando le celle, facendo uso della soluzione di tripsina-EDTA (Sigma), dopo che sono sotto-confluenti a intorno 75-90% in T75 (area di 75 cm2) fiaschi (falco). La linea cellulare utilizzata per questo studio era la linea cellulare HeLa (Human Cervical cancer cells). Negli esperimenti in cui avevamo bisogno di bloccare il flusso autofagico, le cellule sono state trattate con 400 nM di bafilomicina A1 per 4 ore a 37 °C.

Trasfezione

Le cellule HeLa sono state trasfettate con il plasmide purificato usando il reagente di trasfezione Mirus TransIT-2020. La trasfezione è stata eseguita utilizzando optiMEM medium, utilizzando il protocollo del produttore. In breve, una miscela di 100 µl di optiMEM con 1 µg di DNA è stata preparata e incubata a temperatura ambiente per 5 minuti. Un’altra miscela contenente 100 µl optiMEM con 5 µl di Mirus è stata preparata e incubata per 5 minuti. Entrambe le soluzioni sono state quindi mescolate insieme e incubate per circa 20-25 minuti. Il volume totale è stato quindi aggiunto a un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, contenente già 1 ml di optiMEM. La quantità di DNA generalmente utilizzata per la trasfezione era di 1 µg per un pozzo a 6.

Knockdown mediato da siRNA

Le cellule per il knockdown di siRNA sono state trasfettate usando il reagente di trasfezione lipofectamine 2000. La trasfezione è stata eseguita utilizzando optiMEM medium, utilizzando il protocollo del produttore. In breve, una miscela di 100 µl di optiMEM con 3 µl di 20 µM o 1 µl di 100 µM siRNA è stata preparata e incubata a temperatura ambiente per 5 minuti. Contemporaneamente, un’altra miscela contenente 100 µl optiMEM con 5 µl di Lipofectamina 2000 è stata preparata e incubata per 5 minuti. Entrambe le soluzioni sono state quindi mescolate insieme e incubate per circa 20-25 minuti. Il volume totale è stato quindi aggiunto a un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, contenente già 1 ml di optiMEM per 4 ore a 37 °C. Dopo l’incubazione, i media sono stati cambiati e sostituiti con supporti completi. Le cellule sono state quindi raccolte dopo 48 ore di incubazione se si desiderava un singolo knockdown (KD), come per l’ATG7 e l’ATG10 KD nelle cellule HeLa. Per gli esperimenti di salvataggio ATG7 e ATG10, un pcDNA.3 (vettore vuoto) o ATG7 più ATG10-FLAG sono stati utilizzati per trasfettare le cellule 24 ore dopo la trasfezione siRNA. Per gli studi double KD, abbiamo eseguito un altro ciclo di trasfezione di siRNA, seguendo lo stesso protocollo sopra menzionato, dopo il primo round (per gli studi p62 KD). Per il knockdown di siRNA nelle cellule HepG2, questi sono stati trasfettati usando il reagente di trasfezione max di lipofectamina RNAi utilizzando siRNA finale a 100 nM e sono stati eseguiti due round di trasfezione di siRNA per ottenere un knockdown efficiente. Le cellule sono state poi divise e seminate alle rispettive piastre o coprioggetti per ulteriori esperimenti. Il siRNA strapazzate (ON-TARGETplus Non targeting Pool, D-001810-10), umano SU-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) sono stati ordinati da Dharmacon e utilizzati ad una concentrazione finale di 50-100 nM.

Test GFP-trap

Le cellule HeLa sono state trasfettate con EGFP-LC3 utilizzando il reagente di trasfezione Mirus TransIT-2020 e 24 ore dopo sono state lisate in buffer di lisi (50 mm HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mm MgCl2, 5 mm EGTA) per 10 min su ghiaccio e pellettato per 10 min a 13.000 giri / min. Le proteine con tag GFP (EGFP o EGFP-LC3) sono state abbattute utilizzando perline GFP-TRAP (ChromoTek), secondo il protocollo del produttore. Gli immunoprecipitati sono stati eluiti facendo bollire i campioni nel tampone di Laemmli per 5 min. Le proteine sono state risolte da SDS-PAGE.

Immunofluorescenza

L’immunocitochimica è stata eseguita su cellule coltivate su 22 × 22 mm coprioggetti. Le cellule HeLa sono state coltivate ad una confluenza del 70-80%, lavate una volta con PBS e quindi fissate usando il 4% p/v PFA per 5-7 minuti o il metanolo a freddo per 3-5 minuti a 4 °C. Si noti che poiché la maggior parte degli anticorpi utilizzati nello studio ha funzionato solo dopo la fissazione del PFA, i campioni sono stati generalmente fissati con il 4% p/v PFA in PBS se non diversamente menzionato nella legenda(e) della figura. Il PFA è stato scartato in conformità con le norme di sicurezza e le celle sono state lavate tre volte con PBS. Le cellule sono state quindi permeabilizzate utilizzando 0.5% v / v Triton X-100 per 5-7 minuti e lavato tre volte con PBS per rimuovere qualsiasi detergente residuo. Una soluzione contenente 1% p/v BSA è stata quindi aggiunta sui coprioggetti, come soluzione bloccante, per ridurre il legame non specifico degli anticorpi primari e secondari e mantenuta per 1 ora a temperatura ambiente. La soluzione di blocco è stata quindi estratta dai coprioggetti e gli anticorpi primari alle diluizioni appropriate sono stati aggiunti sui coprioggetti. I coprioggetti con anticorpi primari sono stati incubati a 4 °C per 16-20 ore in una camera umida e umida. I coprioggetti sono stati successivamente lavati tre volte con PBS e incubati con una soluzione contenente anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. (Si noti che le soluzioni anticorpali primarie e secondarie sono state fatte nel tampone di blocco.) La diluizione degli anticorpi secondari utilizzati per questo studio è stata di 1:400 preparati in soluzione di BSA all ‘ 1% p/V. Infine, i coprioggetti sono stati lavati due volte con PBS e acqua sterile ad alta purezza e montati su vetrini utilizzando il supporto di montaggio DAPI anti-fade Pro-Long gold (Invitrogen, US). I coprioggetti sono stati poi ripresi utilizzando il microscopio confocale Zeiss LSM880 o LSM780 utilizzando l’obiettivo ad immersione in olio 63x.

Live-cell imaging

ATG16L1-le cellule knockout sono state seminate sui piatti MatTek (MatTek, Ashland MA USA). Il giorno seguente, queste cellule sono state trasfettate con plasmide appropriato in base alle esigenze sperimentali utilizzando il reagente di trasfezione Mirus Trans-IT 2020. La trasfezione è stata eseguita utilizzando optiMEM medium, utilizzando il protocollo del produttore. Una soluzione madre Triton X-100 al 2% è stata quindi utilizzata per raggiungere la concentrazione designata per l’estrazione detergente della membrana plasmatica. Una concentrazione finale di 1% Triton X-100 è in grado di estrarre il citosolico e la membrana legata. L’esperimento per confermare la presenza di aggregati p62 nelle cellule ATG16L1-knockout, tuttavia, ha coinvolto l’estrazione del detergente utilizzando l ‘ 1,5% di Triton X-100 come concentrazione finale per sottoporre le cellule a condizioni di estrazione più dure. L’imaging è stato quindi eseguito utilizzando il modulo “Serie temporali” su un microscopio Zeiss AxioObserver Z1 incubato con un microscopio confocale LSM780 utilizzando una lente ad immersione in olio Apochromat 63 × 1,4 NA Plan.

Microscopia a super risoluzione

I campioni sono stati seminati su Zeiss High precision No 1.5 170+ o -5 µm, coprioggetti da 18 mm × 18 mm. Dopo la colorazione, i campioni sono stati montati in supporto di montaggio DAPI anti-fade oro Pro-Long (Life Technologies) e lasciati indurire per 3 giorni per raggiungere un indice di rifrazione costante (RI) di 1,46. I campioni sono stati fotografati utilizzando l’illuminazione strutturata sulla Elyra PS1 (microscopia Carl Zeiss). Dopo l’allineamento dello stadio, le linee laser di 405, 488 e 561 nm sono state utilizzate per l’immagine di una pila di perline al fine di correggere l’aberrazione cromatica utilizzando l’algoritmo di allineamento dei canali. Gli Z-stack sono stati acquisiti in 5 fasi e 5 rotazioni della griglia di illuminazione e successivamente elaborati e allineati utilizzando il software ZEN Black Elyra edition (Microscopia Carl Zeiss).

Estrazione di frazioni solubili e insolubili

L’estrazione delle frazioni solubili e insolubili dalle celle ATG16L1-knockout è stata eseguita nel tampone RIPA. In breve, le cellule sono state lavate con 1X PBS ghiacciato una volta e sono state raschiate, lisate in 500 µl di tampone RIPA e raccolte in provette etichettate tenute su ghiaccio. La composizione del buffer RIPA era la seguente:

Buffer RIPA

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mm NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Desossicolato di sodio

0.1% SDS

Al momento dell’uso, il tampone RIPA è stato integrato con una compressa completa di inibitore della proteasi (1 compressa per 50 ml) e cocktail di inibitori della fosfatasi 2 e 3 (1:100 ciascuno).

I lisati sono stati quindi fatti passare attraverso un ago da 25 G 10 volte e quindi la soluzione è stata centrifugata a 14000 giri / min per 15 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato raccolto in un tubo di Eppendorf fresco ed è stato etichettato come frazione solubile ed è stato mescolato con 300 µl di 2X tampone di Laemmli ed è stato bollito per 5 minuti. Il pellet ottenuto dopo centrifugazione è costituito dalla frazione insolubile ed è stato risospeso e lavato con 500 µl di tampone RIPA. La soluzione risospesa è stata quindi centrifugata a 14000 giri / min per 5 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato scartato e il pellet è stato risospeso in 100 µl di UREA + tampone RIPA. Questo è stato infine miscelato con 100 µl di 2X tampone Laemmli ed è stato bollito per 5 minuti. La composizione di UREA + tampone RIPA è costituita da urea aggiuntiva ad una concentrazione finale di 2 M insieme ai componenti del tampone RIPA.

Western blot

Le cellule coltivate in piastre a 6 pozzetti sono state lisate e raccolte in 2X tampone Laemmli (4% p/v SDS, 20% v/v glicerolo, 10% v/v 2-mercaptoetanolo, 0,004% p/v blu di bromofenolo e 125 mm Tris HCl, pH 6,8). Dopo che le cellule sono state lisate, 20-30 µl dei campioni sono stati caricati su una pagina SDS da 10 pozzetti, 12-15% ed eseguiti a 100-120 V. Una scala MW standard è stata caricata insieme ai campioni per tenere traccia del movimento delle proteine nel gel. Le proteine sono state poi trasferite sul PVDF attivato a 100 V per 60 minuti. La membrana è stata rimossa al termine del trasferimento ed è stata immersa in latte scremato al 5% p/v per bloccare i siti di legame non specifici, per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, una soluzione contenente anticorpo primario specifico (preparato in latte scremato al 5% p/v) ad una diluizione appropriata è stata aggiunta alla membrana per l’incubazione notturna a 4 °C. Le membrane sono state quindi lavate tre volte con PBST (tampone fosfato salino +0,1% Tween-20) prima dell’aggiunta di anticorpo secondario. L’anticorpo secondario, anch’esso preparato in latte scremato al 5% p/v, è stato incubato con la membrana per 1 ora a temperatura ambiente. La diluizione dell’anticorpo secondario è stata generalmente mantenuta a 1:4000 per gli anticorpi coniugati con HRP a chemiluminescenza potenziata (ECL) e 1:5000 per gli anticorpi coniugati con fluoroforo LICOR. Le membrane sono state quindi lavate nuovamente con PBST più volte e sviluppate utilizzando una miscela di volumi uguali di soluzioni di sviluppo 1 e 2 per ECL o imaged direttamente per il rilevamento del segnale di fluorescenza utilizzando il software LICOR Image Studio (LICOR, US).

CRISPR knockout cell generation

Gli RNA guida sono stati progettati per la generazione di celle knockout ATG9 utilizzando lo strumento online sviluppato da Zhang Lab21. I primi tre colpi di RNA a guida singola (sgRNA) sono stati modificati manualmente per aggiungere siti di restrizione BbsI e queste sequenze di sgRNA di purezza dissalata sono state ordinate da Invitrogen. La sequenza utilizzata con successo per ATG9 CRISPR knockout è stata:

Evidenziato nucleotidi indicare l’aggiunta di sporgenze. Lo sgRNA è stato poi legato nella spina dorsale psCas9-2A-puromicina. I plasmidi legati con successo o il controllo vettoriale Cas9 vuoto sono stati quindi trasfettati nelle cellule HeLa e l’espressione è stata consentita per 24 ore. Le cellule trasfettate sono state quindi selezionate aggiungendo puromicina alle cellule ad una concentrazione finale di 2-4 µg / ml. Le cellule sono state lasciate crescere fino a quando tutte le cellule non trasfette erano morte. Le cellule positive sono state quindi tripsinizzate e il numero di cellule è stato valutato utilizzando vetrini Invitrogen Countess (10 µl di sospensione cellulare omogenea +10 µl di Trypan blue). Sulla base della popolazione di cellule vive, le cellule 0.2 × 104 sono state aspirate e diluite in serie in una piastra a 96 pozzetti per ottenere colonie di cellule singole. La diluizione seriale era sempre 1:1 e il volume finale in ciascun pozzetto alla fine della diluizione è stato mantenuto a 200 µl. I lisati cellulari sono stati quindi caricati su SDS-PAGE, trasferiti su una membrana per verificare il knock-out di ATG9.

Quantificazione dei dati e analisi statistica

Le immagini sono state quantificate utilizzando il plugin predefinito ‘Analizza particelle’ in ImageJ. Inoltre, i pixel co-localizzati sono stati identificati e un profilo è stato generato utilizzando un algoritmo di plugin ImageJ non supervisionato chiamato “colocalization”, sviluppato da Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Parigi; 2003–2004). Le western blot sono state quantificate utilizzando il software LICOR Image Studio (LICOR, US) e i valori sono stati elaborati, analizzati e tracciati utilizzando il programma Excel della suite Microsoft Office.

I livelli di significatività statistica per i confronti tra due gruppi sono stati stimati utilizzando test t a una coda o a due code. Per l’esperimento che ha coinvolto ATG7 e ATG10 KD, è stato utilizzato un test t a coda singola per valutare la significatività statistica dei dati. Per tutti gli altri esperimenti in questo studio, è stato utilizzato un test t a due code per valutare la significatività statistica dei dati. In questo articolo, il valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo e le convenzioni utilizzate per rappresentare i risultati in questo articolo sono le seguenti: * p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; * * * p ≤ 0,001 e le barre di errore rappresentano deviazioni standard se non diversamente menzionato.