LC3陽性構造がオートファジー欠損細胞で顕著
Materials
本研究で用いた抗体は以下の通りである。: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH （ａｂ２ １ ０ ７ ４ ４ ８、Ａｂｃａｍ）およびすべてのＡｌｅｘａ結合二次抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。 ＰＥＧＦＰ−ＬＣ３、ｐＥＧＦＰ−ＬＣ３−Ｇ１ ２ ０ＡおよびＲＦＰ−ＬＣ３構築物は、吉森博士（大阪大学、日本）からの親切な贈り物であった。 ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ（Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏ Ｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＳＡ）からの親切な贈り物であり、Ｃ１−ｍＣｈｅｒｒｙはＣｌｏｎｔｅｃｈ（６ ３ ２ ５ ２ ４）からの親切な贈り物であり、ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐ６ ２およびｍＣｈｅｒｒｙ−ｐ６ ２ＬＩＲ変異体（ＤＤＤＷ３ ３ ５−３ ３ ８ＡＡＡＡ）はＳａｓｃｈａ Ｍａｒｔｅｎｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ Ｆ Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）からの親切な Ｔｅｒｊｅ Ｊｏｈａｎｓｅｎ（Ａｒｔｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｍｙｃ−ＬＣ３−Ｇ１ ２ ０Ａ−Δ Ｃ２ ２は、Ｔ． Ｚｈａｎｇ博士（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６ ２ ９ ８ ８）からの贈り物であった。 pCMV-ATG7は、谷田Isei博士からの親切な贈り物でした。 Ｅｇｆｐ−ＬＣ３Ｋ５ １ＡおよびＥＧＦＰ−ＬＣ３Ｆ５ ２Ａは、ｑ５部位特異的変異誘発キット（ＮＥＢ Ｅ０ ５ ５ ４Ｓ）およびｐＥＧＦＰ−ＬＣ３を鋳型として、製造業者の指示に従って、部位変異誘発によ Ｋ５ １Ａ突然変異のために使用されるプライマー：５’−ｃｃｇｔｃｃｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃ−３’およびＦ５ ２Ａ突然変異のためのプライマー: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.
細胞培養
HeLa細胞を、10％v/vウシ胎児血清、100U/mlペニシリン-ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した。 ＨｅｐＧ２細胞を、１ ０％ｖ／ｖウシ胎児血清、１ ０ ０Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１ ６ ４ ０培地中で維持した。 細胞株を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を使用して、Ｔ７ ５（７ ５ｃｍ２面積）フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で約７ ５〜９ ０％にサブ合流した後、細胞を継代することによって維持した。 本研究に用いた細胞株はＨｅｌａ（ヒト子宮頸癌細胞）細胞株であった。 ＜5150＞＜7679＞トランスフェクション＜5676＞＜3550＞Ｈｅｌａ細胞を、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ−２ ０ ２ ０トランスフェクション試薬を用いて精製プラスミドでトランスフェクションした。＜5150＞＜7679＞トランスフェクション＜5676＞＜3550＞Ｈｅｌａ細胞を、精製プラスミドでトランスフェクションした。＜5150＞＜7679＞トランスフェクション＜5676＞＜3550＞Ｈｅｌａ細胞を、精製プラスミドでトランスフェクションした。＜5150＞＜7679＞トランスフェクション＜5676＞＜3550＞ トランスフェクションは、製造業者のプロトコルを使用して、optiMEM培地を使用して行われた。 簡潔に述べると、１ ０ ０μ ｌのＯｐｔｉＭＥＭと１μ ｇのＤＮＡとの混合物を調製し、室温で５分間インキュベートした。 １ ０ ０μ ｌのＯｐｔｉＭＥＭと５μ ｌのＭｉｒｕｓとを含む別の混合物を調製し、５分間インキュベートした。 次いで、両方の溶液を一緒に混合し、約２ ０〜２ ５分間インキュベートした。 次いで、総体積を、既に１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを含有する６ウェルプレートの１つのウェルに添加した。 トランスフェクションに一般的に使用されるDNAの量は、1μ gの6ウェルであった。
siRNAを介したノックダウン
sirnaノックダウン用細胞をlipofectamine2000transfection reagentを用いてトランスフェクトした。 トランスフェクションは、製造業者のプロトコルを使用して、optiMEM培地を使用して行われた。 簡潔に述べると、１ ０ ０μ ｌのＯｐｔｉＭＥＭと３μ ｌの２ ０μ Ｍまたは１μ ｌの１ ０ ０μ Ｍ ｓｉＲＮＡとの混合物を調製し、室温で５分間インキュベートした。 同時に、１ ０ ０μ ｌのＯｐｔｉＭＥＭと５μ ｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２ ０ ０ ０とを含む別の混合物を調製し、５分間インキュベートした。 次いで、両方の溶液を一緒に混合し、約２ ０〜２ ５分間インキュベートした。 次いで、全体積を、既に１ｍｌのＯｐｔｉｍＥＭを４時間３ ７℃で含有する６ウェルプレートの１つのウェルに添加した。 インキュベーションの後、メディアは変更され、フルメディアに置き換えられました。 次いで、Ｈｅｌａ細胞におけるＡＴＧ７およびＡＴＧ１ ０ＫＤに関しては、単一のノックダウン（Ｋ Ｄ）が所望される場合には、４ ８時間のインキュベーション後に細胞を回収した。 ATG7およびATG10救助実験のために、pcDNA。図３（空のベクター）またはＡＴＧ７＋ＡＴＧ１ ０−ＦＬＡＧを使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２ ４時間後に細胞をトランスフェクトした。 二重ＫＤ研究のために、本発明者らは、最初のラウンド（ｐ６ ２ＫＤ研究のため）の後に、上記と同じプロトコルに従って、別のラウンドのｓｉＲＮＡトランスフェクションを Hepg2細胞におけるsiRNAノックダウンのために、これらは、100nMの最終siRNAを使用してリポフェクトアミンRNAi maxトランスフェクション試薬を使用してトランスフ その後、細胞を分割し、さらなる実験のためにそれぞれのプレートまたはカバースリップに播種した。 スクランブルｓｉＲＮＡ（ＯＮ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｏｏｌ，Ｄ−０ ０ １ ８ １ ０−１ ０）、ヒトＯＮ−ＴａｒｇｅｔＰｌｕｓ ＳＱＳＴＭ１（Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ，Ｌ）-010230-00-0005ヒトＯＮ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ ＡＴＧ７（Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ、Ｌ−０ ２ ０ １ １ ２−０ ０）、ヒトＯｎ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ ＡＴＧ１ ０（Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ、Ｌ−０ １ ９ ４ ２ ６−０ １）をＤｈａｒｍａｃｏｎから注文し、５ ０〜１ ０ ０ｎＭの最終濃度で使用した。＜５ １ ５ ０＞＜７ ６ ７ ９＞ＧＦＰ−ｔｒａｐアッセイ＜５ ６ ７ ６＞＜３ ５ ５ ０＞Ｈｅｌａ細胞を、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ−２ ０ ２ ０ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを用いてＥＧＦＰ−ＬＣ３でトランスフェクトし、２ ４時間後に溶解緩衝液（５ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ、１ ５ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０、１）中で溶解した。5mM Mgcl2、5mM EGTA）を氷上で10分間ペレット化し、13,000rpmで10分間ペレット化した。 ＧＦＰタグ付きタンパク質（ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰ−ＬＣ３）を、製造業者のプロトコルに従って、ＧＦＰ−ＴＲＡＰビーズ（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を使用してプルダウンした。 免疫沈降物は、試料をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で５分間沸騰させることによって溶出した。 タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。
免疫蛍光
免疫細胞化学は、22×22mmのカバースリップ上で増殖させた細胞に対して行われた。 HeLa細胞は70-80％のコンフルエンスで増殖させ、PBSで一度洗浄し、4％w/v pfaを用いて5-7分間、またはコールドメタノールを用いて3-5分間4℃で固定した。 ＰＦＡを安全規則に従って廃棄し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。 次いで、細胞を０を使用して透過させた。5%v/v Triton X-100を5-7分間洗浄し、PBSで三回洗浄して残留洗剤を除去した。 次いで、１％ｗ／ｖのＢＳ Ａを含有する溶液を遮断溶液としてカバースリップ上に添加し、一次抗体および二次抗体の非特異的結合を減少させ、室温で１時間保 次いで、遮断溶液をカバースリップからタップし、適切な希釈での一次抗体をカバースリップ上に添加した。 一次抗体を有するカバースリップは、湿った湿ったチャンバー内で4℃で16-20時間インキュベートした。 次に、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を含有する溶液で室温で１時間インキュベートした。 （一次抗体溶液および二次抗体溶液は、ブロッキング緩衝液中で作製したことに留意されたい。）この試験に使用した二次抗体の希釈は、１％ｗ／ｖ ＢＳ Ａ溶液中で１：４ ０ ０調製した。 最後に、カバースリップを、ＰＢＳおよび高純度滅菌水で２回洗浄し、Ｐｒｏ−Ｌｏｎｇ ｇｏｌｄ ａｎｔｉ−ｆａｄｅ ＤＡＰＩ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用してガラススライド上に装着した。 次いで、カバースリップを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８ ８ ０またはＬＳＭ７ ８ ０共焦点顕微鏡を使用して、６ ３ｘ油浸対物レンズを使用して撮像した。＜５ １ ５ ０＞＜７ ６ ７ ９＞ライブセルイメージング＜５ ６ ７ ６＞＜３ ５ ５ ０＞ＡＴＧ１ ６Ｌ１ノックアウト細胞をＭａｔｔｅｋディッシュ（Ｍａｔｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ Ｍ Ａ ＵＳＡ）に播種した。 翌日、これらの細胞を、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓ−ＩＴ２ ０ ２ ０ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを使用した実験的要件に基づいて、適切なプラスミドで形質移入した。 トランスフェクションは、製造業者のプロトコルを使用して、optiMEM培地を使用して行われた。 次いで、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０ストック溶液を使用して、原形質膜の洗剤抽出のために指定された濃度に到達した。 最終濃度1％Triton X-100は、細胞質および膜結合を抽出することができる。 ATG16L1ノックアウト細胞におけるp62凝集体の存在を確認するための実験は、しかし、抽出の厳しい条件に細胞を対象とする最終濃度として1.5％トリトンX-100を使用して洗剤抽出を関与した。 その後、63×1.4NA Plan Apochromat油浸レンズを用いたLSM780共焦点顕微鏡を用いて、インキュベートされたZeiss AxioObserver Z1顕微鏡上の”時系列”モジュールを用いて撮像を行った。
超解像顕微鏡
サンプルをZeiss High precision No1.5 170+または-5μ m、18mm×18mmカバースリップに播種しました。 染色後、試料を、Ｐｒｏ−Ｌｏｎｇ ｇｏｌｄ ａｎｔｉ−ｆａｄｅ ＤＡＰＩ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に装着し、３日間硬化させて、１.４ ６の一定屈折率（ＲＩ）に到達させた。 試料を、Ｅｌｙｒａ ＰＳ１（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）上の構造化照明を使用して撮像した。 段階の直線の後で、405、488および561nmのレーザーラインはチャネルの直線のアルゴリズムを使用して色収差を訂正するためにビードの積み重ねをイメージする Ｚスタックを、照明グリッドの５段階および５回転で取得し、続いて、ＺＥＮ Ｂｌａｃｋ Ｅｌｙｒａ ｅｄｉｔｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して処理および整列させた。
可溶性および不溶性画分の抽出
ATG16L1ノックアウト細胞からの可溶性および不溶性画分の抽出をRIPA緩衝液中で行った。 簡単に説明すると、細胞を１Ｘ氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、掻き取り、５ ０ ０μ ｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、氷上に保持された標識管中に回収した。 ＲＩＰＡ緩衝液の組成は以下の通りであった−＜５ １ ５ ０＞＜３ ５ ５ ０＞ＲＩＰＡ緩衝液＜５ １ ５ ０＞＜３ ５ ５ ０＞５ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．-100
0.5% デオキシコール酸ナトリウム
0.1%SDS
使用時に、RIPA緩衝液に完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤（1錠/50ml）とホスファターゼ阻害剤カクテル2および3（各1:100）を補充した。＜5150＞＜3550＞その後、溶解物を25Gの針に10回通過させ、次いで溶液を14000rpmで15分間4℃で遠心分離した。遠心分離後、上清を新鮮なEppendorfチューブに集め、可溶性画分と標識し、300μ lの2X Laemmli緩衝液と混合し、5分間煮沸した。 遠心分離後に得られたペレットは、不溶性画分からなり、再懸濁し、５ ０ ０μ ｌのＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した。 上清を廃棄し、ペレットを尿素＋ＲＩＰＡ緩衝液１ ０ ０μ ｌに再懸濁した。 これを最終的に１ ０ ０μ ｌの２Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、５分間煮沸した。 尿素＋ＲＩＰＡ緩衝液の組成は、ＲＩＰＡ緩衝液の成分と共に２Ｍの最終濃度の追加の尿素からなる。
ウェスタンブロット
6ウェルプレートで培養した細胞を溶解し、2X Laemmli緩衝液(4%W/v SDS、20%v/vグリセロール、10%v/v2-メルカプトエタノール、0.004%w/vブロモフェノールブルー、125mMトリスHCl、pH6.8)中に回収した。 細胞を溶解した後、２ ０〜３ ０μ ｌの試料を１ ０ウェル、１ ２〜１ ５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードし、１ ０ ０〜１ ２ ０Ｖで実行した。 次いで、タンパク質を活性化ＰＶＤＦ上に１ ０ ０Ｖで６ ０分間移動させた。 転写の完了時に膜を除去し、非特異的結合部位を遮断するために５％ｗ／ｖ脱脂乳に室温で１時間浸漬した。 さらに、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ＋０． また、５％ｗ／ｖ脱脂乳中で調製した二次抗体を、膜と共に室温で１時間インキュベートした。 二次抗体の希釈は、一般に、増強された化学ルミネセンス（ECL）HRP結合抗体のための1：4000およびLICOR fluorophore結合抗体のための1：5000に保たれた。 次いで、膜をＰＢＳＴで再び複数回洗浄し、ＥＣＬのために等量の現像液１および２の混合物を使用して現像するか、またはＬＩＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＩＣＯＲ、ＵＳ）を使用して蛍光信号検出のた
CRISPRノックアウト細胞生成
Guide Rnaは、Zhang Lab21が開発したオンラインツールを使用してATG9ノックアウト細胞の生成のために設計されました。 トップ３つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ヒットを手動で改変して、Ｂｂｓｉ制限部位を添加し、脱塩純度のこれらのｓｇＲＮＡ配列をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから注文した。 ATG9CRISPRノックアウトに正常に使用された配列は次のとおりであった:
| 配列（5’3′) | |
| sgRNA | CACCGCTGTTGGTGCACGTCGCCGA |
| AAACTCGGCGACGTGCACCAACAGC |
強調表示されたヌクレオチドは、追加されたオーバーハングを示します。 その後、ｓｇＲＮＡをＰｓｃＡｓ９−２Ａ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ骨格中に連結した。 その後、首尾よく連結されたプラスミドまたは空のＣａｓ９ベクター対照を、Ｈｅｌａ細胞中にトランスフェクトし、発現を２ ４時間放置した。 次いで、形質移入された細胞を、2〜4μ g/mlの最終濃度で細胞にピューロマイシンを添加することによって選択した。 全ての非形質移入細胞が死滅するまで、細胞を増殖させた。 次いで、陽性細胞をトリプシン化し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ｓｌｉｄｓ（１ ０μ ｌ均質細胞懸濁液＋１ ０μ Ｌ Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）を用いて細胞数を評価した。 生細胞集団に基づいて、0.2×104個の細胞を吸引し、96ウェルプレート中で連続的に希釈して、単一細胞コロニーを得た。 シリアルナンバーは常に1:1および希釈の終了時の各ウェル中の最終容積を200μ lに保った。 次いで、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに装填し、膜に移して、ＡＴＧ９のノックアウトを確認した。
データの定量化と統計分析
画像はImageJのデフォルトの”Analyze particles”プラグインを使用して定量化しました。 さらに、共局在化されたピクセルを同定し、Ｐｉｅｒｒｅ Ｂｏｕｒｄｏｎｃｌｅ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｍｏｎｏｄ，Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｍａｇｅｒｉｅ，Ｐａｒｉｓ）によって開発された「ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ」と呼ばれる教師なしＩｍａｇｅｊプラグインアルゴリズムを使用してプロフ; 2003–2004). ウェスタンブロットを、ＬＩＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬＩＣＯＲ，ＵＳ）を使用して定量化し、値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｆｉｃｅ ｓｕｉｔｅからのＥｘｃｅｌプログラムを使用して処理し、分析し、プロットした。
2つのグループ間の比較の統計的有意性レベルは、片側または両側のt検定を用いて推定した。 ＡＴＧ７およびＡＴＧ１ ０ＫＤを含む実験では、片側ｔ検定を使用して、データの統計的有意性を評価した。 この研究の他のすべての実験について、両側ｔ検定を使用してデータの統計的有意性を評価した。 このホワイトペーパーでは、p<0.05の値は統計的に有意であると考えられており、この記事全体の結果を表すために使用される規則は次のとおりです。*p≤0.05;**p≤0.01;***p≤0.001およびエラーバーは、特に言及されていない限り、標準偏差を表しています。