LC3-positive strukturer er fremtrædende i autofagi-mangelfulde celler

materialer

antistofferne anvendt i denne undersøgelse er: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) og alle de Aleksa-konjugerede sekundære antistoffer blev købt fra Invitrogen. PEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A og RFP-LC3 konstruktioner var venlige gaver fra Dr. T. Yoshimori (Osaka University, Japan). ATG9A-pEGFP var en venlig gave fra Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mcherry var fra Clontech (632524), mCherry-p62 og mCherry-p62 lir mutant (335-338aaaa) var en venlig gave fra Dr. Sascha Martens (University of Vienna, Østrig), p62-pEGFP var en venlig gave fra Dr. Terje Johansen (Artic University, Norge), mens Myc-LC3-G120A-LARSC22 var en gave fra Dr. T. Yoshimori (Addgen plasmid # 45449). Pspcas9 (BB)-2A-Puro (PKS459) V2.0 var en gave fra Dr. F. Jang (addgen plasmid # 62988). pCMV-ATG7 var en venlig gave fra Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A og EGFP-LC3F52A blev oprettet ved hjælp af stedmutagenese ved hjælp af det Stedstyrede Mutagenesesæt i 5.kvartal (NEB E0554S) og pEGFP-LC3 som en skabelon i henhold til producentens anvisninger. Primere anvendt til k51a-mutationen: 5′-ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3′ og til f52a-mutationen: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

cellekultur

HeLa-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% V/V føtal bovint serum, 100 E/ml penicillin-streptomycin og 2 mM L-glutamin. HepG2-celler blev opretholdt i rpmi 1640-medium suppleret med 10% V/V føtal bovint serum, 100 U/ml penicillin-streptomycin, alle opnået fra Sigma, UK. Cellelinjerne blev opretholdt ved at passere cellerne ved hjælp af Trypsin-EDTA-opløsning (Sigma), efter at de er sammenfaldende til omkring 75-90% i T75 (75 cm2 areal) kolber (Falcon). Cellelinjen anvendt til denne undersøgelse var hela (Human cervical cancer cells) cellelinje. I eksperimenter, hvor vi havde brug for at blokere autofagisk strømning, blev celler behandlet med 400 nM bafilomycin A1 i 4 timer ved 37 liter C.

transfektion

HeLa-cellerne blev transfekteret med det oprensede plasmid ved hjælp af mirus TransIT-2020 transfektionsreagens. Transfektionen blev udført ved hjælp af optiMEM-medium ved hjælp af producentens protokol. Kort fortalt blev en blanding af 100 liter optiMEM med 1 liter DNA fremstillet og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter. En anden blanding indeholdende 100 liter optiMEM med 5 liter Mirus blev fremstillet og inkuberet i 5 minutter. Begge opløsninger blev derefter blandet sammen og inkuberet i cirka 20-25 minutter. Det samlede volumen blev derefter tilsat til en brønd af en 6-brøndsplade, der allerede indeholdt 1 ml optiMEM. Mængden af DNA, der generelt blev anvendt til transfektion, var 1 liter for en 6-brønd.

siRNA-medieret nedslagning

cellerne til nedslagning af siRNA blev transficeret ved hjælp af lipofectamine 2000 transfektionsreagens. Transfektionen blev udført ved hjælp af optiMEM-medium ved hjælp af producentens protokol. Kort fortalt blev en blanding af 100 liter optiMEM med 3 liter på 20 liter eller 1 liter på 100 liter siRNA fremstillet og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter. Samtidig blev en anden blanding indeholdende 100 liter optiMEM og 5 liter Lipofectamin 2000 fremstillet og inkuberet i 5 minutter. Begge opløsninger blev derefter blandet sammen og inkuberet i cirka 20-25 minutter. Det samlede volumen blev derefter tilsat til en brønd på en 6-brøndsplade, der allerede indeholdt 1 ml optiMEM i 4 timer ved 37 liter C. Efter inkubationen blev medierne ændret og erstattet med fulde medier. Cellerne blev derefter høstet efter 48 timers inkubation, hvis en enkelt nedslagning (KD) var ønsket, som for Atg7 og atg10 KD i HeLa-celler. For atg7 og atg10 redningseksperimenter, en pcDNA.3 (tom vektor) eller atg7 plus atg10-FLAG blev brugt til at transficere celler 24 timer efter siRNA-transfektionen. For dobbelt KD-studier udførte vi en anden runde af siRNA-transfektion efter den samme protokol som nævnt ovenfor efter den første runde (for p62 KD-studier). Til nedbrydning af siRNA i HepG2-celler blev disse transficeret ved hjælp af Lipofectamin RNAi maks transfektionsreagens ved anvendelse af 100 nM endelig siRNA og to runder af siRNA-transfektion blev udført for at opnå en effektiv nedbrydning. Celler blev derefter delt og podet til respektive plader eller dækglas til yderligere eksperimenter. Den krypterede siRNA (on-TARGETplus ikke-målrettet Pool, D-001810-10), menneskelig on-TARGETplus kvm 1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human on-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human on-TARGETplus atg10 (SMARTpool, L-019426-01) blev bestilt fra Dharmacon og anvendt i en endelig koncentration på 50-100 nM.

GFP-fældeanalyser

HeLa-celler blev transficeret med EGFP-LC3 ved hjælp af mirus TransIT-2020 transfektionsreagens, og 24 timer senere blev de lyseret i lysisbuffer (50 mm HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton * – 100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) i 10 minutter på is og pelleteret i 10 minutter ved 13.000 omdr. / min. GFP-mærkede proteiner (EGFP eller EGFP-LC3) blev trukket ned ved hjælp af GFP-FÆLDEPERLER (ChromoTek) i henhold til producentens protokol. Immunopræcipitater blev elueret ved kogning af prøverne i Laemmli-buffer i 5 minutter. Proteiner blev løst af SDS-PAGE.

immunofluorescens

immunocytokemien blev udført på celler dyrket på 22 liter 22 mm dækglas. HeLa-celler blev dyrket ved en sammenløb på 70-80%, vasket en gang med PBS og derefter fikseret enten ved hjælp af 4% vægt/v PFA i 5-7 minutter eller koldmethanol i 3-5 minutter ved 4-kar C. Bemærk, at da de fleste af de antistoffer, der blev anvendt i undersøgelsen, kun fungerede efter PFA-fiksering, blev prøverne generelt fikseret med 4% vægt/v PFA i PBS, medmindre andet er nævnt i figurlegenden (- erne). PFA blev kasseret i overensstemmelse med sikkerhedsforskrifterne, og cellerne blev vasket tre gange med PBS. Cellerne blev derefter permeabiliseret under anvendelse af 0.5% v/V Triton 100 i 5-7 minutter og vaskes tre gange med PBS for at fjerne eventuelt resterende vaskemiddel. En opløsning indeholdende 1% vægt/v BSA blev derefter tilsat på dækslipene som en blokerende opløsning for at reducere den ikke-specifikke binding af de primære og sekundære antistoffer og holdt i 1 time ved stuetemperatur. Den blokerende opløsning blev derefter tappet af dækglassene, og de primære antistoffer ved passende fortyndinger blev tilsat på dækglassene. Dækglassene med primære antistoffer blev inkuberet ved 4 liter C i 16-20 timer i et fugtigt og fugtigt kammer. Dækglassene blev derefter vasket tre gange med PBS og inkuberet med en opløsning indeholdende sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. (Bemærk, at de primære og sekundære antistofopløsninger blev fremstillet i blokeringsbufferen.) Fortyndingen af de sekundære antistoffer, der blev anvendt til denne undersøgelse, var 1:400 fremstillet i 1% vægt/v BSA-opløsning. Endelig blev dækglas vasket to gange med PBS og sterilt vand med høj renhed og monteret på glasrutschebaner ved hjælp af Pro-Long Gold anti-fade DAPI monteringsmedium (Invitrogen, US). Dækslipene blev derefter afbildet ved hjælp af Konfokalt mikroskop med 63 gange olie nedsænkningsmål.

levende cellebilleddannelse

Atg16l1-knockout-celler blev podet på MatTek-skålene (MatTek, Ashland MA USA). Den følgende dag blev disse celler transficeret med passende plasmid baseret på eksperimentelle krav ved anvendelse af Mirus Trans-it 2020 transfektionsreagens. Transfektionen blev udført ved hjælp af optiMEM-medium ved hjælp af producentens protokol. En 2% Triton 100 stamopløsning blev derefter anvendt til at nå den udpegede koncentration til vaskemiddelekstraktion af plasmamembranen. En endelig koncentration på 1% Triton H-100 er i stand til at ekstrahere det cytosoliske og membranbundne. Forsøget med at bekræfte tilstedeværelsen af P62-aggregater i atg16l1-knockout-celler involverede imidlertid vaskemiddelekstraktion ved hjælp af 1,5% Triton 100 som den endelige koncentration for at udsætte cellerne for hårdere ekstraktionsbetingelser. Billeddannelse blev derefter udført ved hjælp af ‘tidsserie’ – modulet på et inkuberet tidsserie Aksioobserver S1-mikroskop med et lsm780 konfokalt mikroskop ved hjælp af en 63 liter 1,4 NA Plan Apochromat olie-nedsænkningslinse.

superopløsningsmikroskopi

prøver blev podet på Højpræcisionsnr.1,5 170+ eller -5 Liter, 18 mm Liter 18 mm dækglas. Efter farvning blev prøverne monteret i Pro-lang guld anti-fade DAPI monteringsmedium (Life Technologies) og efterladt til at hærde i 3 dage for at nå et konstant brydningsindeks (RI) på 1,46. Prøver blev afbildet ved hjælp af struktureret belysning på Elyra PS1 (Carl Seiss mikroskopi). Efter trinjustering blev laserlinjer på 405, 488 og 561 nm brugt til at afbilde en perlestabel for at korrigere for kromatisk aberration ved hjælp af kanaljusteringsalgoritmen. Stakke blev erhvervet ved 5 faser og 5 rotationer af belysningsgitteret og efterfølgende behandlet og justeret ved hjælp af den sorte Elyra edition-programmel (Carl Seiss Microscopy).

ekstraktion af opløselige og uopløselige fraktioner

ekstraktionen af de opløselige og uopløselige fraktioner fra atg16l1-knockout-celler blev udført i RIPA-buffer. Kort sagt blev cellerne vasket med 1 gange iskold PBS en gang og skrabet, lyseret i 500 liter RIPA-buffer og opsamlet i mærkede rør, der blev holdt på is. Sammensætningen af RIPA-bufferen var som følger –

RIPA-buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton-100

0.5% Natriumdeoksicholat

0.1% SDS

på brugstidspunktet blev RIPA-buffer suppleret med komplet proteasehæmmertablet (1 tablet pr.50 ml) og phosphatasehæmmercocktails 2 og 3 (1:100 hver).

lysaterne blev derefter ført gennem en 25 g nål 10 gange, og derefter blev opløsningen centrifugeret ved 14000 o / min i 15 minutter ved 4 liter C. efter centrifugering blev supernatanten opsamlet i et frisk Eppendorf-rør og blev mærket som den opløselige fraktion og blev blandet med 300 liter 2 gange Laemmli-buffer og blev kogt i 5 minutter. Pelleten opnået efter centrifugering består af den uopløselige fraktion og blev resuspenderet og vasket med 500 liter RIPA-buffer. Den resuspenderede opløsning blev derefter centrifugeret ved 14000 omdr. / min. i 5 minutter ved 4 liter C. supernatanten blev kasseret, og pelleten blev resuspenderet i 100 liter urinstof + RIPA-buffer. Dette blev til sidst blandet med 100 liter 2 gange Laemmli-buffer og blev kogt i 5 minutter. Sammensætningen af urinstof + RIPA-buffer består af yderligere urinstof i en slutkoncentration på 2 M sammen med komponenterne i RIPA-buffer.

vestlig plet

celler dyrket i 6-brøndsplader blev lyseret og opsamlet i 2 gange laemmli-buffer (4% vægt/v SDS, 20% V/V glycerol, 10% v/v 2-mercaptoethanol, 0,004% vægt/v bromphenolblåt og 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Efter at cellerne blev lyseret, blev 20-30 liter af prøverne indlæst på en 10-brønd, 12-15% SDS-side og kørt ved 100-120 V. en standard M. V. stige blev indlæst sammen med prøverne for at holde styr på bevægelsen af proteinerne i gelen. Proteinerne blev derefter overført til den aktiverede PVDF ved 100 V i 60 minutter. Membranen blev fjernet ved afslutningen af overførslen og blev gennemblødt i 5% vægt/v skummetmælk for at blokere ikke-specifikke bindingssteder i 1 time ved stuetemperatur. Dernæst blev en opløsning indeholdende specifikt primært antistof (fremstillet i 5% vægt/v skummetmælk) ved en passende fortynding tilsat på membranen til inkubation natten over ved 4 liter C. membranerne blev derefter vasket tre gange med PBST (phosphatbuffer saltvand +0,1% mellem-20) inden tilsætning af sekundært antistof. Det sekundære antistof, også fremstillet i 5% vægt/v skummetmælk, blev inkuberet med membranen i 1 time ved stuetemperatur. Fortyndingen af det sekundære antistof blev generelt holdt ved 1:4000 for forbedret kemiluminescens (ECL) HRP-konjugerede antistoffer og 1:5000 for LICOR fluorophore-konjugerede antistoffer. Membranerne blev derefter vasket igen med PBST flere gange og udviklet ved hjælp af en blanding af lige store mængder af udviklingsopløsninger 1 og 2 til ECL eller afbildet direkte til fluorescenssignaldetektion ved hjælp af LICOR Image Studio-program (LICOR, US).

CRISPR knockout cell generation

guide-RNA ‘ erne blev designet til generering af atg9 knockout-celler ved hjælp af onlineværktøjet udviklet af Jang Lab21. De tre øverste enkelt guide RNA (sgRNA) hits blev modificeret manuelt for at tilføje BbsI restriktionssteder, og disse sgRNA-sekvenser af afsaltet renhed blev bestilt fra Invitrogen. Sekvensen med succes anvendt til ATG9 CRISPR knockout var:

de fremhævede nukleotider angiver de tilsatte overhæng. SgRNA blev derefter ligeret i pscas9-2a-puromycin rygraden. De med succes ligerede plasmider eller tom Cas9-vektorkontrol blev derefter transficeret i HeLa-celler, og ekspressionen blev tilladt i 24 timer. Transfekterede celler blev derefter udvalgt ved tilsætning af puromycin til cellerne i en endelig koncentration på 2-4 liter/ml. Celler fik lov til at vokse, indtil alle de ikke-transficerede celler var døde. De positive celler blev derefter trypsiniseret, og celletallet blev vurderet ved hjælp af Invitrogen-grevindeglas (10 homogen cellesuspension med en ren prisl +10 trypanblå). Baseret på den levende cellepopulation blev 0,2 liter 104 celler aspireret og serielt fortyndet i en 96-brøndsplade for at opnå enkeltcellekolonier. Den serielle fortynding var altid 1:1 og det endelige volumen i hver brønd ved slutningen af fortyndingen blev holdt til 200 liter. Cellelysaterne blev derefter indlæst på SDS-side, overført til en membran for at kontrollere, om atg9 blev slået ud.

kvantificering af data og statistisk analyse

billederne blev kvantificeret ved hjælp af standard ‘analyser partikler’ plugin i ImageJ. Derudover blev de co-lokaliserede billedpunkter identificeret, og en profil blev genereret ved hjælp af en uovervåget ImageJ-pluginalgoritme kaldet ‘colocalisering’, som blev udviklet af Pierre Bourdoncle (Institut Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). De vestlige blots blev kvantificeret ved hjælp af LICOR Image Studio-programmet (LICOR, USA), og værdierne blev behandlet, analyseret og plottet ved hjælp af Microsoft Office-pakken.

de statistiske signifikansniveauer for sammenligninger mellem to grupper blev estimeret ved hjælp af en-tailed eller to-tailed t-test. Til eksperimentet, der involverede atg7 og atg10 KD, blev en-tailed t-test brugt til at vurdere den statistiske signifikans af dataene. For alle de andre eksperimenter i denne undersøgelse blev en to-tailed t-test anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af dataene. I dette papir blev værdien af p < 0,05 betragtet som statistisk signifikant, og konventionerne, der blev brugt til at skildre resultaterne på tværs af denne artikel, er som følger: *p-0,05; **p-0,01; ***p-0,001 og fejllinjer repræsenterer standardafvigelser, medmindre andet er nævnt.