LC3-positive strukturer er fremtredende i autofagi-mangelfulle celler

Materialer

antistoffene som brukes i denne studien er: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) og Alle Alexa-konjugerte sekundære antistoffer ble kjøpt fra Invitrogen. PEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A og RFP-LC3 konstruksjonene var hyggelige gaver fra Dr. T. Yoshimori (Osaka University, Japan). Atg9a-pEGFP var en snill gave Fra Dr Y. Takahashi (Penn State College Of Medicine, USA), C1-mCherry var Fra Clontech (632524), mCherry-p62 OG mCherry-p62 LIR mutant (DDDW335-338AAAA) var En snill gave Fra Dr. Sascha Martens (Universitetet I Wien, Østerrike), p62-pEGFP var En snill gave Fra Dr. Terje Johansen (Artic University, Norge), Mens Myc-LC3-G120A-Δ 22 var en gave fra Dr. T. Yoshimori (Addgene plasmid # 45449). Pspcas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2. 0 var en gave Fra Dr. F. Zhang (Addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 var en snill gave Fra Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A og EGFP-LC3F52A ble opprettet av site mutagenesis ved Hjelp Av Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) og pEGFP-LC3 som en mal i henhold til produsentens instruksjoner. Primere brukt FOR k51a-mutasjonen: 5 ‘- ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ‘ og for f52a-mutasjonen: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Cellekultur

HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% v/v føtalt bovint serum, 100 E/ml penicillin-streptomycin og 2 mM l-glutamin. HepG2-celler ble opprettholdt I rpmi 1640 medium supplert med 10% v/v føtalt bovint serum, 100 E/ml penicillin-streptomycin, alle hentet fra Sigma, STORBRITANNIA. Cellelinjene ble opprettholdt ved å passere cellene, ved Hjelp Av Trypsin-EDTA-løsning (Sigma), etter at de er underkonfluente til rundt 75-90% I t75 (75 cm2 område) flasker (Falk). Cellelinjen som ble brukt til denne studien var HeLa (Human cervical cancer cells) cellelinje. I eksperimenter der vi trengte å blokkere autofagisk flux, ble celler behandlet med 400 nM bafilomycin A1 i 4 timer ved 37 °C.

Transfeksjon

HeLa-cellene ble transfisert med det rensede plasmidet ved Hjelp Av Mirus Transfeksjon-2020 transfeksjonsreagensen. Transfeksjonen ble utført ved bruk av optiMEM medium, ved hjelp av produsentens protokoll. I korte trekk ble det laget en blanding av 100 µ optiMEM med 1 µ DNA og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. En annen blanding inneholdende 100 µ optiMEM og 5 µ av Mirus ble tilberedt og inkubert i 5 minutter. Begge løsningene ble deretter blandet sammen og inkubert i omtrent 20-25 minutter. Det totale volumet ble deretter tilsatt til en brønn med en 6-brønnplate, som allerede inneholdt 1 ml optiMEM. MENGDEN DNA som vanligvis ble brukt til transfeksjon var 1 µ for en 6-brønn.

siRNA-mediert knockdown

cellene for siRNA knockdown ble transfisert ved hjelp av lipofectamine 2000 transfeksjon reagens. Transfeksjonen ble utført ved bruk av optiMEM medium, ved hjelp av produsentens protokoll. Kort fortalt ble en blanding av 100 µ av optiMEM med 3 µ av 20 µ eller 1 µ av 100 µ ble tilberedt og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. Samtidig ble en annen blanding inneholdende 100 µ optiMEM og 5 µ Lipofektamin 2000 tilberedt og inkubert i 5 minutter. Begge løsningene ble deretter blandet sammen og inkubert i omtrent 20-25 minutter. Det totale volumet ble deretter tilsatt til en brønn på en 6-brønnplate, som allerede inneholdt 1 ml optiMEM i 4 timer ved 37 °C. Etter inkubasjonen ble media endret og erstattet med full media. Cellene ble deretter høstet etter 48 timers inkubasjon hvis en enkelt knockdown (KD) var ønsket, som FOR ATG7 og ATG10 KD I HeLa-celler. For atg7 og ATG10 redningseksperimenter, en pcDNA.3 (tom vektor) ELLER ATG7 pluss ATG10-FLAGG ble brukt til å transfisere celler 24 timer etter siRNA-transfeksjonen. For doble kd-studier utførte vi en annen runde siRNA-transfeksjon, etter samme protokoll som nevnt ovenfor, etter første runde (for p62 KD-studier). For siRNA knockdown I HepG2 celler, disse ble transfisert Ved Hjelp Av Lipofectamine rnai max transfeksjon reagens ved hjelp av 100 nM endelig siRNA og to runder med siRNA transfeksjon ble utført for å oppnå en effektiv knockdown. Cellene ble deretter delt og sådd til respektive plater eller dekkglass for videre eksperimenter. Kryptert siRNA (På TARGETplus Ikke-målretting Basseng, D-001810-10), menneskelig På TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human On-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, l-019426-01) ble bestilt Fra Dharmacon og brukt i en endelig konsentrasjon på 50-100 nM.

gfp-felle analyser

HeLa celler ble transfisert MED EGFP-LC3 Ved Hjelp Av Mirus TransIT-2020 transfeksjon reagens og 24 timer senere ble lysert i lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MGCL2, 5 mM EGTA) i 10 min på is og pelletert i 10 min ved 13.000 rpm. Gfp-merkede proteiner (EGFP eller EGFP-LC3) ble trukket ned ved HJELP AV Gfp-FELLEPERLER (ChromoTek), i henhold til produsentens protokoll. Immunoprecipitates ble eluert ved å koke prøvene I Laemmli buffer i 5 min. Proteiner ble løst AV SDS-SIDE.

Immunfluorescens

immunocytokjemi ble utført på celler dyrket på 22 × 22 mm dekkglass. HeLa-celler ble dyrket ved en konfluens på 70-80%, vasket en gang MED PBS og deretter festet enten ved hjelp av 4% w / v PFA i 5-7 minutter eller kaldmetanol i 3-5 minutter ved 4 °C. Vær oppmerksom på at siden de fleste antistoffene som ble brukt i studien, bare virket ved pfa-fiksering, ble prøvene vanligvis festet med 4% w / v PFA i PBS, med mindre annet er nevnt i figurlegenden(e). PFA ble kassert i samsvar med sikkerhetsforskriften og cellene ble vasket tre ganger med PBS. Cellene ble deretter permeabilisert ved bruk av 0.5% V / V Triton X-100 i 5-7 minutter og vasket tre ganger med PBS for å fjerne eventuelle rester av vaskemiddel. En oppløsning inneholdende 1% w / v BSA ble deretter tilsatt på dekslene, som en blokkerende løsning, for å redusere den ikke-spesifikke bindingen av de primære og sekundære antistoffene, og holdt i 1 time ved romtemperatur. Blokkeringsløsningen ble deretter tappet av dekslene og de primære antistoffene ved passende fortynninger ble tilsatt på dekslene. Dekkglassene med primære antistoffer ble inkubert ved 4 °C i 16-20 timer i et fuktig og fuktig kammer. Dekslene ble deretter vasket tre ganger med PBS og inkubert med en løsning som inneholdt sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. (Merk at de primære og sekundære antistoffløsninger ble gjort i blokkeringsbufferen.) Fortynningen av de sekundære antistoffene som ble brukt i denne studien var 1: 400 fremstilt i 1% w/v bsa-oppløsning. Til slutt ble dekkglass vasket to ganger med PBS og sterilt vann med høy renhet og montert på glassglass ved Hjelp Av Pro-Long gold anti-fade DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). Dekkglassene ble deretter avbildet Ved Hjelp Av Zeiss LSM880 eller LSM780 confocal mikroskop ved hjelp av 63x olje nedsenking mål.

Live-cell imaging

ATG16L1-knockout celler ble sådd på MatTek retter(MatTek, Ashland MA USA). Dagen etter ble disse cellene transfisert med passende plasmid basert på eksperimentelle krav ved Bruk Av Mirus Trans-IT 2020 transfeksjonsreagenset. Transfeksjonen ble utført ved bruk av optiMEM medium, ved hjelp av produsentens protokoll. En 2% triton X-100 lageroppløsning ble deretter brukt til å nå den angitte konsentrasjonen for vaskemiddelekstraksjon av plasmamembranen. En endelig konsentrasjon på 1% Triton X-100 er i stand til å trekke ut cytosolisk og membranbundet. Forsøket for å bekrefte tilstedeværelsen av p62-aggregater I ATG16L1-knockout-celler involverte imidlertid vaskemiddelutvinning ved bruk av 1,5% Triton X-100 som den endelige konsentrasjonen for å utsette cellene for strengere ekstraksjonsbetingelser. Imaging deretter ble utført ved Hjelp Av ‘tidsserie’ modul på en inkubert Zeiss AxioObserver Z1 mikroskop MED EN LSM780 konfokale mikroskop ved hjelp av en 63 × 1.4 NA Plan Apochromat olje-nedsenking linse.

superoppløsningsmikroskopi

Prøver ble sådd på Zeiss Høy presisjon Nei 1.5 170+ eller -5 µ, 18 mm × 18 mm dekkglass. Etter farging ble prøvene montert I Pro-Long gold anti-fade DAPI monteringsmedium (Life Technologies) og igjen for å herde i 3 dager for å nå en konstant Brytningsindeks (RI) på 1,46. Prøver ble avbildet Ved Hjelp Av Strukturert Belysning På Elyra PS1 (Carl Zeiss Mikroskopi). Etter trinnjustering ble laserlinjer på 405, 488 og 561 nm brukt til å avbilde en perlestabel for å korrigere for kromatisk aberrasjon ved hjelp av kanaljusteringsalgoritmen. Z-stabler ble anskaffet i 5 faser og 5 rotasjoner av belysningsruten og deretter behandlet og justert ved HJELP AV ZEN Black Elyra edition-programvaren (Carl Zeiss Mikroskopi).

Ekstraksjon av oppløselige og uoppløselige fraksjoner

ekstraksjonen av oppløselige og uoppløselige fraksjoner fra atg16l1-knockout-celler ble utført I RIPA buffer. Kort tid ble cellene vasket med 1x iskalde PBS en gang og ble skrapt, lysert i 500 µ RIPA buffer og samlet i merkede rør holdt på is. SAMMENSETNINGEN AV RIPA buffer var som følger –

RIPA buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Natriumdeoksykolat

0.1% SDS

VED bruk BLE RIPA buffer supplert med komplett proteasehemmertablett (1 tablett per 50 ml) og fosfatasehemmertabletter 2 og 3 (1:100 hver).

lysatene ble deretter ført gjennom en 25 g nål 10 ganger og deretter ble oppløsningen sentrifugert ved 14000 rpm i 15 minutter ved 4 °C. etter sentrifugering ble supernatanten samlet i et nytt eppendorf-rør og ble merket som den oppløselige fraksjonen og ble blandet med 300 µ 2X Laemmli buffer og ble kokt i 5 minutter. Pelleten oppnådd etter sentrifugering består av den uoppløselige fraksjonen og ble resuspendert og vasket med 500 µ RIPA buffer. Den resuspenderte oppløsningen ble deretter sentrifugert ved 14000 o / min i 5 minutter ved 4 °C. supernatanten ble kassert og pelleten ble resuspendert i 100 µ UREA + RIPA buffer. Dette ble til slutt blandet med 100 µ AV 2x Laemmli buffer og ble kokt i 5 minutter. SAMMENSETNINGEN AV UREA + RIPA buffer består av ytterligere Urea ved en endelig konsentrasjon på 2 M sammen med KOMPONENTENE I RIPA buffer.

Western blot

Celler dyrket i 6-brønnplater ble lysert og samlet i 2x Laemmli buffer (4% w / v SDS, 20% v/v glyserol, 10% v/v 2-merkaptoetanol, 0,004% w/v bromfenol blå og 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Etter at cellene ble lysert, ble 20-30 µ av prøvene lastet på en 10-brønn, 12-15% SDS-SIDE og kjørt ved 100-120 V. en standard Mw-stige ble lastet sammen med prøvene for å holde rede på bevegelsen av proteinene i gelen. Proteinene ble deretter overført til aktivert PVDF ved 100 V i 60 minutter. Membranen ble fjernet ved fullføring av overføringen og ble gjennomvåt i 5% w / v skummet melk for å blokkere ikke-spesifikke bindingssteder, i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble en oppløsning inneholdende spesifikt primært antistoff (fremstilt i 5% w/v skummet melk) ved en passende fortynning tilsatt membranen for inkubering over natten ved 4 °C. membranene ble deretter vasket tre ganger med PBST (Fosfatbuffer saline + 0,1% Tween-20) før tilsetning av sekundært antistoff. Det sekundære antistoffet, også fremstilt i 5% w/v skummet melk, ble inkubert med membranen i 1 time ved romtemperatur. Fortynningen av det sekundære antistoffet ble vanligvis holdt på 1: 4000 for forbedret kjemiluminescens (ECL) HRP-konjugerte antistoffer og 1:5000 FOR LICOR fluorofor-konjugerte antistoffer. Membranene ble deretter vasket igjen med PBST flere ganger og utviklet ved hjelp av en blanding av like mengder utviklingsløsninger 1 og 2 FOR ECL eller avbildet direkte for fluorescenssignaldeteksjon ved HJELP AV LICOR Image Studio-programvare (LICOR, USA).

CRISPR knockout cell generation

guiden Rna ble designet for generering AV ATG9 knockout celler ved hjelp av online verktøy utviklet Av Zhang Lab21. De tre beste single guide RNA (sgRNA) treff ble endret manuelt for å legge Til BbsI begrensning nettsteder og disse sgrna sekvenser av avsaltet renhet ble bestilt Fra Invitrogen. Sekvensen vellykket brukt FOR ATG9 CRISPR knockout var:

de uthevede nukleotidene indikerer de tilsatte overhengene. SgRNA ble deretter ligert i psCas9-2a-puromycin ryggraden. De vellykket ligerte plasmider eller tom Cas9 vektorkontroll ble deretter transfisert I HeLa-celler og uttrykket ble tillatt i 24 timer. Transfiserte celler ble deretter selektert ved å tilsette puromycin til cellene med en endelig konsentrasjon på 2-4 µ / ml. Celler fikk lov til å vokse til alle de ikke-transfiserte cellene var døde. De positive cellene ble deretter trypsinisert og celletallet ble vurdert ved Bruk Av Invitrogen grevinne-lysbilder (10 µ homogen cellesuspensjon +10 µ Trypanblå). Basert på levende cellepopulasjon ble 0,2 × 104 celler aspirert og serielt fortynnet i en 96-brønnsplate for å oppnå enkeltcellekolonier. Seriell fortynning var alltid 1:1 og det endelige volumet i hver brønn ved slutten av fortynningen ble holdt til 200 µ. Cellelysatene ble deretter lastet på SDS-SIDE, overført til en membran for å sjekke om utblåsningen AV ATG9.

Kvantifisering av data og Statistisk analyse

bildene ble kvantifisert ved hjelp av standard’ Analyser partikler ‘ plugin I ImageJ. I tillegg ble de samlokaliserte pikslene identifisert, og en profil ble generert ved hjelp av en uovervåket ImageJ plugin algoritme kalt ‘colocalization’, som ble utviklet Av Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). Western blots ble kvantifisert VED HJELP AV LICOR Image Studio-programvaren (LICOR, USA) og verdiene ble behandlet, analysert og plottet ved Hjelp Av Excel-programmet Fra Microsoft Office-pakken.

de statistiske signifikansnivåene for sammenligninger mellom to grupper ble estimert ved hjelp av en-tailed eller to-tailed t-tester. For forsøket med ATG7 OG ATG10 KD ble en-tailed t-test brukt til å vurdere den statistiske signifikansen av dataene. For alle de andre forsøkene i denne studien ble en to-tailed t-test brukt til å vurdere statistisk signifikans av dataene. I dette papiret ble verdien av p < 0,05 ansett som statistisk signifikant, og konvensjonene som brukes til å skildre resultatene i denne artikkelen er som følger: * p ≤ 0,05; * * p ≤ 0,01; * * * p ≤ 0,001 og feilfelt representerer standardavvik med mindre annet er nevnt.