Calmoduline

Calmoduline interacties met Ca2+ en met NOS

CaM is een klein Ca2 + – bindend eiwit (molecuulgewicht 17 kDa) dat bestaat uit twee soortgelijke bolvormige kwabben verbonden door een centraal linkergebied. Elke kwab bevat twee E-F handen, waaronder een N-terminal helix (e helix), een centraal gelegen Ca2+ coördinerende lus, en een C-terminal helix (F helix) (domeinen van CaM worden over het algemeen aangeduid als 1-4 van n naar C terminal). Op het binden van Ca2+, kan CaM aan meer dan 30 doelenzymen binden en activeren, die het toelaten om talrijke tweede boodschappers en celfuncties te regelen. De band en de volledige activering van doelproteã nen door CaM vereisen typisch bezetting van alle vier Ca2+-bindende plaatsen in CaM. De carboxy-terminale kwab bevat twee hoog-affiniteit Ca2 + – bindende plaatsen, terwijl de amino-terminale kwab twee plaatsen met lagere Ca2+ affiniteit bevat. Conformationele veranderingen komen voor in CaM nadat het Ca2 + bindt: hydrophobic oppervlakteresiduen worden blootgesteld om cruciale Van der Waals interacties te vormen met het hydrophobic gezicht van de doelpeptide herkenningsplaats.

CaM bindt aan elke NOS-subeenheid in een 1:1-stoichiometrie met een redelijk hoge affiniteit. Bindingsaffiniteit studies met peptiden die overeenkomen met nos nos nos herkenningssequenties tonen aan dat de drie nos verschillende affiniteiten vertonen ten opzichte van NOS Met als algemene orde cytokine-induceerbare NOS (iNOS) ≫ neuronale NOS (nNOS) ≈ endothelial NOS (Enos). INOS-peptide bindt goed aan CaM zowel in aanwezigheid als afwezigheid van Ca2+, maar Enos-en nNOS-peptiden binden aan de CaM alleen in aanwezigheid van Ca2+.

elke kwab van CaM bindt onafhankelijk aan NOS en vertoont verschillende affiniteiten ten opzichte van NOS. de interactie tussen CaM en nNOS is onderzocht met behulp van CaM-mutanten en plantaardige CaM-eiwitten. nNOS vertoont een hoge mate van structurele specificiteit ten opzichte van CaM domeinen 1, 3, en mogelijk 4 met betrekking tot activering van heem reductie en geen synthese. De interactie tussen CaM en nNOS is bijzonder belangrijk voor de elektronenoverdracht en betreft het sluitgebied van CaM (gevormd door CaM domeinen 1 en 3) en een methionineresidu in domein 4. Deze gebieden van CaM lijken te interageren met nog onbekende gebieden op nNOS die onderscheiden zijn van zijn canonieke CaM-bindende volgorde. De last en de lengte van de centrale linker worden ook gevonden om de band en activering van inos door elektrostatische interactie in de centrale linker en hydrophobic interactie in het bolvormige domein van CaM te beà nvloeden, die van zijn strakke vereniging aan Inos verantwoordelijk schijnt te zijn. De Ca2+ – dissociatie van NOS-gebonden Nob vindt plaats in twee opeenvolgende stappen: de snelle Ca2+-dissociatie van de N-terminale kwab vindt eerst plaats en komt overeen met de inactivering van NOS-synthese, gevolgd door een langzamere Ca2+ – dissociatie van de C-terminale kwab, wat leidt tot de dissociatie van NOS. Conformational veranderingen komen in NOS CaM-bindende peptides voor wanneer zij CaM binden. Typisch, verwerven peptides een α-spiraalvormige bouw op interactie met Ca2 + gebonden CaM. Een CaM-veroorzaakte conformational verandering in het NOS reductase domein komt ook voor zoals aangewezen door veranderingen in proteã ne en flavine fluorescentie en door een verandering in het trypsine proteolyse patroon.

er is een kristallografische structuur beschikbaar van Ca2+-geladen NOK, gebonden aan een 20-residupeptide dat overeenkomt met de Enos-Nokherkenningssequentie. De structuur toonde aan dat het α-spiraalvormige Enos-peptide in een antiparalleloriëntatie door uitgebreide hydrofobe interacties bindt: de N-terminale en C – terminale kwabben van CaM wikkelen rond het gebonden peptide, die respectievelijk met de C-en N-terminale helften van het peptide in wisselwerking staan. Specifieke CaM residuen in het sluitgebied en domein 4 werden gepositioneerd op een wijze die overeenstemt met hun belang zoals bepaald door mutagenesestudies. De kristalstructuur suggereerde ook een basis voor strakkere Nokbinding in iNOS: omdat iNOS een groter aantal hydrofobe residuen bevat binnen de bijbehorende CaM-herkenningssequentie, werd betoogd dat deze uitgebreidere van der Waals-contacten met CaM zouden ondersteunen en ongunstige blootstelling van hydrofobe residuen aan oplosmiddelen zouden minimaliseren om een strakkere associatie tussen CaM en de Inos CaM-herkenningssequentie te bevorderen.

de kristalstructuur van een complex tussen Ca2+/CaM en het FMN-domein van menselijk Inos is ook beschikbaar. Vier verschillende conformaties werden geà dentificeerd in de structuur van het complex, die de flexibele aard van CAM en FMN domein–domein interacties aantoont. Een zoutbrug die wordt gevormd tussen nok en het FMN-domein is duidelijk in de structuur en kan belangrijk zijn voor het transduceren van het effect van Nokbinding op NOS-functies.