LC3-positieve structuren zijn prominent aanwezig in autofagie-deficiënte cellen

materialen

: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) en alle Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen werden gekocht van Invitrogen. De pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A en RFP-LC3 constructies waren Vriendelijke geschenken van Dr. T. Yoshimori (Osaka University, Japan). ATG9A-pEGFP was een vriendelijk geschenk van Dr. Y. Takahashi (Penn State College Of Medicine, USA), C1-mCherry was van Clontech (632524), mCherry-p62 en MCHERRY-P62 LIR mutant (DDDW335-338AAAA) was een vriendelijk geschenk van Dr. Sascha Martens (Universiteit van Wenen, Oostenrijk), p62-pEGFP was een vriendelijk geschenk van Dr. Terje Johansen (Artic University, Noorwegen), terwijl Myc-LC3-G120A-ΔC22 een geschenk was van Dr.T. Yoshimori (Addgene plasmide # 45449). De pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 was een geschenk van dr.F. Zhang (Addgene plasmide # 62988). pCMV-ATG7 was een vriendelijk geschenk van Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A en EGFP-LC3F52A werden gecreëerd door site mutagenese met behulp van de Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) en pEGFP-LC3 als een sjabloon volgens de instructies van de fabrikant. Primers gebruikt voor de k51a mutatie: 5 ‘-ccgtcctggacaagaccgttccttgtacctgatc-3 ‘ en voor de f52a mutatie: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

celkweek

HeLa-cellen werden gekweekt in Dulbecco ‘ s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v foetaal runderserum, 100 E/ml penicillinestreptomycine en 2 mM L-glutamine. HepG2-cellen werden gehandhaafd in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% V/v foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline-streptomycine, allemaal verkregen uit Sigma, UK. De cellijnen werden gehandhaafd door de cellen te passeren, met behulp van trypsine-EDTA-oplossing (Sigma), nadat ze sub-samenvloeien tot rond 75-90% in T75 (75 cm2 gebied) kolven (Falcon). De cellijn die voor dit onderzoek werd gebruikt, was de cellijn van HeLa (Humane cervicale kankercellen). In experimenten waarbij we autofagische flux moesten blokkeren, werden cellen behandeld met 400 nM bafilomycine A1 gedurende 4 uur bij 37 °C.

transfectie

de HeLa-cellen werden getransfecteerd met het gezuiverde plasmide met behulp van het Mirus TransIT-2020 transfectie reagens. De transfectie werd uitgevoerd met behulp van optiMEM medium, met behulp van het Protocol van de fabrikant. Kort, werd een mengsel van 100 µl optiMEM met 1 µg DNA bereid en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Een ander mengsel met 100 µl optiMEM en 5 µl Mirus werd bereid en gedurende 5 minuten geïncubeerd. Beide oplossingen werden vervolgens gemengd en gedurende ongeveer 20-25 minuten geïncubeerd. Het totale volume werd vervolgens toegevoegd aan een putje van een 6-Wells plaat, die al 1 ml optiMEM bevat. De hoeveelheid DNA die over het algemeen voor transfectie wordt gebruikt was 1 µg voor een 6-goed.

siRNA-gemedieerde knockdown

de cellen voor siRNA knockdown werden getransfecteerd met behulp van lipofectamine 2000 transfectiereagens. De transfectie werd uitgevoerd met behulp van optiMEM medium, met behulp van het Protocol van de fabrikant. In het kort werd een mengsel van 100 µl optiMEM met 3 µl 20 µM of 1 µl 100 µM siRNA bereid en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Tegelijkertijd werd een ander mengsel met 100 µl optiMEM en 5 µl Lipofectamine 2000 bereid en gedurende 5 minuten geïncubeerd. Beide oplossingen werden vervolgens gemengd en gedurende ongeveer 20-25 minuten geïncubeerd. Het totale volume werd vervolgens toegevoegd aan één putje van een plaat met 6 boorputten, die al gedurende 4 uur bij 37 °C 1 ml optiMEM bevatte. Na de incubatie werd de media vervangen door volledige media. De cellen werden dan geoogst na 48 uur incubatie als een enkele knockdown (KD) gewenst was, zoals voor de ATG7 en ATG10 KD in HeLa cellen. Voor de atg7 en ATG10 reddingsexperimenten, een pcDNA.3 (lege vector) of ATG7 plus ATG10-vlag werden gebruikt om cellen 24hrs na de siRNA-transfectie te transfecteren. Voor dubbele KD studies, voerden we een nieuwe ronde van siRNA transfectie, volgens hetzelfde protocol als hierboven vermeld, na de eerste ronde (voor p62 KD studies). Voor siRNA knockdown in HepG2 cellen, werden deze transfected gebruikend Lipofectamine RNAi maximum transfectie reagens gebruikend 100 nM definitieve siRNA en twee rondes van siRNA transfectie werden uitgevoerd om een efficiënte knockdown te bereiken. Cellen werden vervolgens gesplitst en gezaaid naar respectieve platen of coverslips voor verdere experimenten. De scrambled siRNA (ON-TARGETplus Non-targeting Pool, D-001810-10), menselijke ON-TARGETplus SQSTM1( SMARTpool, L-010230-00-0005), human ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) werden besteld bij Dharmacon en gebruikt in een uiteindelijke concentratie van 50-100 nM.

GFP-trap assays

HeLa cellen werden getransfecteerd met EGFP-LC3 met behulp van Mirus TransIT-2020 transfectiereagens en 24 uur later werden gelyseerd in lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) gedurende 10 min op ijs en gepelleteerd gedurende 10 min bij 13.000 rpm. GFP-geëtiketteerde proteã nen (EGFP of EGFP-LC3) werden neer getrokken gebruikend GFP-VALPARELS (ChromoTek), volgens het protocol van de fabrikant. Immunoprecipitaten werden geëlueerd door de monsters gedurende 5 minuten in laemmli-buffer te koken. De proteã nen werden opgelost door SDS-PAGE.

immunofluorescentie

de immunocytochemie werd uitgevoerd op cellen gekweekt op 22 × 22 mm coverslips. HeLa-cellen werden gekweekt met een samenloop van 70-80%, eenmaal gewassen met PBS en vervolgens gefixeerd met 4% G/v PFA gedurende 5-7 minuten of koud-methanol gedurende 3-5 minuten bij 4 °C. Houd er rekening mee dat, aangezien de meeste in het onderzoek gebruikte antilichamen alleen werkten bij PFA-fixatie, de monsters in het algemeen werden gefixeerd met 4% G/v PFA in PBS, tenzij anders vermeld in de figuur legende(s). PFA werd weggegooid in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften en de cellen werden driemaal gewassen met PBS. De cellen werden vervolgens permeabilised gebruikend 0.5% V/v Triton X-100 gedurende 5-7 minuten en drie keer gewassen met PBS om eventuele resterende detergent te verwijderen. Vervolgens werd een oplossing met 1% G/v BSA toegevoegd aan de coverslips, als een blokkerende oplossing, om de niet-specifieke binding van de primaire en secundaire antilichamen te verminderen, en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bewaard. De blokkerende oplossing werd vervolgens van de coverslips afgetapt en de primaire antilichamen bij geschikte verdunningen werden toegevoegd aan de coverslips. De coverslips met primaire antilichamen werden gedurende 16-20 uur bij 4 °C geïncubeerd in een vochtige en vochtige kamer. De coverslips werden vervolgens driemaal gewassen met PBS en geïncubeerd met een oplossing die secundaire antilichamen bevat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. (Merk op dat de primaire en secundaire antilichaamoplossingen in de blokkerende buffer werden gemaakt.) De verdunning van de secundaire antilichamen die voor dit onderzoek werden gebruikt was 1:400 bereid in 1% G/v BSA-oplossing. Tot slot werden coverslips tweemaal gewassen met PBS en steriel water van hoge zuiverheid en gemonteerd op glazen dia ‘ s met behulp van Pro-Long gold anti-fade DAPI montagemedium (Invitrogen, VS). De coverslips werden vervolgens afgebeeld met behulp van de Zeiss lsm880 of lsm780 confocal microscoop met behulp van de 63x oil immersion objective.

live-cell imaging

ATG16L1-knockoutcellen werden op de MatTek schalen gezaaid (MatTek, Ashland MA USA). De volgende dag, werden deze cellen getransfecteerd met aangewezen plasmide die op experimentele vereisten wordt gebaseerd gebruikend Mirus Trans-IT 2020 transfectiereagens. De transfectie werd uitgevoerd met behulp van optiMEM medium, met behulp van het Protocol van de fabrikant. Vervolgens werd een 2% Triton X-100 stamoplossing gebruikt om de aangewezen concentratie te bereiken voor de extractie van het plasmamembraan met detergenten. Een uiteindelijke concentratie van 1% Triton X-100 is in staat om de cytosolic en membraan gebonden te extraheren. Het experiment om de aanwezigheid van P62-aggregaten in atg16l1-knockoutcellen te bevestigen, betrof echter detergentenextractie met 1,5% Triton X-100 als uiteindelijke concentratie om de cellen aan hardere extractieomstandigheden te onderwerpen. Beeldvorming werd vervolgens uitgevoerd met behulp van de’ tijdreeks ‘ module op een geïncubeerde Zeiss AxioObserver Z1 microscoop met een lsm780 confocale microscoop met behulp van een 63 × 1.4 na Plan Apochromat olie-immersielens.

Super-resolutiemicroscopie

monsters werden gezaaid op Zeiss High precision no.1,5 170+ of -5 µm, 18 mm × 18 mm coverslips. Na het bevlekken, werden de steekproeven in Pro-Long gouden anti-fade het opzetten medium van DAPI (het Levenstechnologieën) opgezet en gelaten om 3 dagen te verharden om een constante brekingsindex (RI) van 1.46 te bereiken. De steekproeven werden afgebeeld gebruikend gestructureerde verlichting op de Elyra PS1 (de microscopie van Carl Zeiss). Na fase-uitlijning werden laserlijnen van 405, 488 en 561 nm gebruikt om een kralenstapel in beeld te brengen om chromatische aberratie te corrigeren met behulp van het kanaal-uitlijningsalgoritme. Z-stacks werden verworven in 5 fasen en 5 rotaties van het verlichtingsrooster en vervolgens verwerkt en uitgelijnd met behulp van de Zen Black Elyra edition software (Carl Zeiss Microscopy).

extractie van oplosbare en onoplosbare fracties

de extractie van de oplosbare en onoplosbare fracties uit atg16l1-knockoutcellen werd uitgevoerd in RIPA buffer. Kort, de cellen werden gewassen met 1x ijskoude PBS eenmaal en werden geschraapt, gelyseerd in 500 µl RIPA buffer en verzameld in geëtiketteerde buizen bewaard op ijs. De samenstelling van RIPA buffer was als volgt –

RIPA buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Natriumdeoxycholaat

0.1% SDS

op het moment van gebruik werd RIPA buffer aangevuld met een complete proteaseremmertablet (1 tablet per 50 ml) en fosfataseremmercocktails 2 en 3 (elk 1:100).

de lysaten werden vervolgens 10 maal door een naald van 25 G geleid en vervolgens werd de oplossing bij 14000 toeren per minuut gedurende 15 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd. na centrifugering werd het supernatant verzameld in een verse Eppendorf-buis en geëtiketteerd als de oplosbare fractie, gemengd met 300 µl 2x laemmli-buffer en gedurende 5 minuten gekookt. De na centrifugering verkregen pellet bestaat uit de onoplosbare fractie en is geresuspendeerd en gewassen met 500 µl RIPA-buffer. De geresuspendeerde oplossing werd vervolgens gecentrifugeerd bij 14000 toeren per minuut gedurende 5 minuten bij 4 °C. Het supernatans werd weggegooid en de pellet werd geresuspendeerd in 100 µl ureum + RIPA buffer. Dit werd uiteindelijk gemengd met 100 µl 2x laemmli buffer en werd 5 minuten gekookt. De samenstelling van ureum + RIPA buffer bestaat uit extra ureum bij een eindconcentratie van 2 M samen met de bestanddelen van RIPA buffer.

Western blot

cellen gekweekt in 6-putplaten werden gelyseerd en verzameld in 2X Laemmli-buffer (4% G/v SDS, 20% V/V glycerol, 10% v/v 2-mercaptoethanol, 0,004% g/v broomfenolblauw en 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Nadat de cellen werden lysed, werden 20-30 µl van de steekproeven geladen op een 10-goed, 12-15% SDS-pagina en lopen bij 100-120 V. een standaard M. W. ladder werd geladen samen met de steekproeven om een spoor van de beweging van de proteã nen in het gel te houden. De proteã nen werden toen overgebracht op geactiveerde PVDF bij 100 V gedurende 60 minuten. Het membraan werd na de overdracht verwijderd en werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 5% g/v magere melk geweekt om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Vervolgens werd een oplossing met specifiek primair antilichaam (bereid in 5% g/v magere melk) in een geschikte verdunning toegevoegd aan het membraan voor incubatie ‘ s nachts bij 4 °C. De membranen werden vervolgens driemaal gewassen met PBST (fosfaatbuffer zoutoplossing +0,1% Tween-20) Voordat secundaire antilichaam werd toegevoegd. Het secundaire antilichaam, ook bereid in 5% g/v magere melk, werd geïncubeerd met het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De verdunning van het secundaire antilichaam werd over het algemeen gehouden bij 1:4000 voor verbeterde chemiluminescentie (ECL) HRP-geconjugeerde antilichamen en 1:5000 voor LICOR fluorophore-geconjugeerde antilichamen. De membranen werden vervolgens meerdere malen gewassen met PBST en ontwikkeld met behulp van een mengsel van gelijke volumes van het ontwikkelen van oplossingen 1 en 2 voor ECL of direct afgebeeld voor fluorescentie signaal detectie met behulp van LICOR Image Studio software (LICOR, US).

CRISPR knockoutcelgeneratie

de guide RNAs zijn ontworpen voor het genereren van atg9 knockoutcellen met behulp van de online tool ontwikkeld door Zhang Lab21. De hoogste drie enige slagen van gidsrna (sgRNA) werden handmatig gewijzigd om BbsI beperkingsplaatsen toe te voegen en deze sgrna opeenvolgingen van ontzouten zuiverheid werden bevolen van Invitrogen. De reeks met succes gebruikt voor atg9 CRISPR knockout was:

De gemarkeerde nucleotiden geven aan de toegevoegde overhangen. De sgrna werd vervolgens geligeerd in de pscas9-2A-puromycine backbone. De met succes gelaagde plasmiden of lege Cas9 vectorcontrole werden toen transfected in HeLa cellen en de uitdrukking werd toegestaan voor 24 uren. Transfected cellen werden vervolgens geselecteerd door puromycine toe te voegen aan de cellen bij een uiteindelijke concentratie van 2-4 µg/ml. Cellen mochten groeien tot alle niet-getransfecteerde cellen dood waren. De positieve cellen werden vervolgens trypsiniseerd en het aantal cellen werd beoordeeld met behulp van Invitrogen Countess-objectglaasjes (10 µl homogene celsuspensie +10 µl Trypanblauw). Gebaseerd op de levende celpopulatie, werden 0,2 × 104 cellen opgezogen en serieel verdund in een 96-well plaat om eencellige kolonies te verkrijgen. De seriële verdunning was altijd 1:1 en het eindvolume in elk putje aan het einde van de verdunning werd op 200 µl gehouden. De cel lysaten werden toen geladen op SDS-pagina, overgebracht naar een membraan om de knock-out van ATG9 te controleren.

kwantificering van gegevens en statistische analyse

de beelden werden gekwantificeerd met behulp van de standaard “analyseer deeltjes” – plugin in ImageJ. Daarnaast werden de co-gelokaliseerde pixels geïdentificeerd en werd een profiel gegenereerd met behulp van een niet-gecontroleerd ImageJ plugin algoritme genaamd ‘colocalization’, dat werd ontwikkeld door Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Parijs; 2003–2004). De western blots werden gekwantificeerd met behulp van de LICOR Image Studio-software (LICOR, US) en de waarden werden verwerkt, geanalyseerd en uitgezet met behulp van het Excel-programma uit de Microsoft Office-suite.

de statistische significantieniveaus voor vergelijkingen tussen twee groepen werden geschat aan de hand van een-of twee-tailed t-tests. Voor het experiment waarbij ATG7 en ATG10 KD betrokken waren, werd éénstaart t-test gebruikt om de statistische significantie van de gegevens te beoordelen. Voor alle andere experimenten in deze studie werd een tweestaart t-test gebruikt om de statistische significantie van de gegevens te beoordelen. In dit artikel werd de waarde van p < 0,05 als statistisch significant beschouwd en de conventies die worden gebruikt om de resultaten in dit artikel weer te geven zijn als volgt: *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001 en foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties, tenzij anders vermeld.