struktury LC3-dodatnie są widoczne w komórkach z niedoborem autofagii

materiały

przeciwciała użyte w tym badaniu to: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) i wszystkie wtórne przeciwciała sprzężone z Alexą zostały zakupione od Invitrogenu. Konstrukcje pEGFP-LC3, pEGFP-lc3-G120A i RFP-LC3 były życzliwymi podarunkami od Dr T. Yoshimori (Uniwersytet w Osace, Japonia). ATG9A-pEGFP był miłym prezentem od Dr Y. Takahashi (Penn State College Of Medicine, USA), C1-mCherry pochodziło od Clontech (632524), mCherry-P62 i mCherry-P62 lir mutant (DDDW335-338aaaa) był miłym prezentem od Dr Sascha Martens (Uniwersytet w Wiedniu, Austria), P62-pEGFP był miłym prezentem od Dr. Terje Johansen (Artic University, Norwegia), natomiast Myc-LC3-G120A-ΔC22 był prezentem od Dr T. Yoshimori (Addgene plasmid # 45449). Pspcas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 był prezentem od Dr. F. Zhanga (Addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 był miłym prezentem od Dr Isei Tanidy. EGFP-LC3K51A i EGFP-LC3F52A zostały utworzone przez mutagenezę w miejscu przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Q5 (NEB E0554S) i pEGFP-lc3 jako szablonu zgodnie z instrukcjami producenta. Startery stosowane dla mutacji K51A: 5′-ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ’ oraz dla mutacji F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

komórki HeLa hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle (Dmem) Dulbecco, uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 100 J./ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM L-glutaminy. Komórki HepG2 utrzymywano w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 100 J/ml penicyliny-streptomycyny, wszystkie uzyskane z Sigma, Wielka Brytania. Linie komórkowe utrzymywano przez przepuszczanie komórek przy użyciu roztworu trypsyny-EDTA (Sigma), po ich podkonfluencie do około 75-90% w kolbach T75 (powierzchnia 75 cm2). Linia komórkowa użyta do tego badania to linia komórkowa Hela (ludzkie komórki raka szyjki macicy). W eksperymentach, w których musieliśmy zablokować strumień autofagiczny, komórki traktowano 400 nM bafilomycyny A1 przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.

transfekcja

komórki HeLa transfekowano oczyszczonym plazmidem przy użyciu odczynnika transfekcji mirus TransIT-2020. Transfekcję przeprowadzono przy użyciu medium optiMEM, przy użyciu protokołu producenta. Krótko przygotowano mieszaninę 100 µl optimemu z 1 µg DNA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Inną mieszaninę zawierającą 100 µl optimemu z 5 µl Miru przygotowano i inkubowano przez 5 minut. Następnie oba roztwory zmieszano ze sobą i inkubowano przez około 20-25 minut. Następnie całkowitą objętość dodano do jednej studzienki z 6-studzienkowej płytki, zawierającej już 1 ml optimemu. Ilość DNA zwykle używanego do transfekcji wynosiła 1 µg dla 6-studzienki.

knockdown z udziałem siRNA

komórki do knockdown z udziałem siRNA transfekowano za pomocą odczynnika do transfekcji lipofektaminy 2000. Transfekcję przeprowadzono przy użyciu medium optiMEM, przy użyciu protokołu producenta. Krótko przygotowano mieszaninę 100 µl optimemu z 3 µl 20 µM lub 1 µl 100 µM siRNA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Jednocześnie przygotowano kolejną mieszaninę zawierającą 100 µl optimemu z 5 µl Lipofektaminy 2000 i inkubowano przez 5 minut. Następnie oba roztwory zmieszano ze sobą i inkubowano przez około 20-25 minut. Następnie całkowitą objętość dodano do jednej studzienki z 6-studzienkowej płytki, zawierającej już 1 ml optimemu przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zmieniono media i zastąpiono je pełnymi mediami. Następnie komórki pobrano po 48 godzinach inkubacji, jeśli pożądany był pojedynczy knockdown (KD), jak w przypadku ATG7 i ATG10 KD w komórkach HeLa. Do eksperymentów ratunkowych ATG7 i ATG10 pcDNA.3 (pusty wektor) lub ATG7 plus ATG10-FLAG użyto do transfekcji komórek 24 godziny po transfekcji siRNA. W przypadku badań z podwójnym KD wykonaliśmy kolejną rundę transfekcji siRNA, zgodnie z tym samym protokołem, jak wspomniano powyżej ,po pierwszej rundzie (w przypadku badań z p62 KD). W przypadku knockdown siRNA w komórkach HepG2 transfekowano je za pomocą odczynnika do transfekcji lipofektaminy RNAi max przy użyciu końcowego siRNA o długości 100 nM i przeprowadzono dwie rundy transfekcji siRNA w celu uzyskania skutecznego knockdown. Komórki następnie dzielono i sadzono do odpowiednich płytek lub pokrywek w celu dalszych eksperymentów. Scrambled siRNA (on-TARGETplus Non-targeting Pool, D-001810-10), human on-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human on-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human on-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) zostały zamówione w Dharmacon i użyte w końcowym stężeniu 50-100 nM.

testy GFP-trap

komórki HeLa transfekowano EGFP-LC3 przy użyciu odczynnika do transfekcji mirus TransIT-2020, a 24 godziny później lizowano w buforze do lizy (50 mm HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) przez 10 min na lodzie i granulowane przez 10 min przy 13 000 obr. / min. Białka znakowane GFP (EGFP lub EGFP-LC3) były usuwane za pomocą kulek GFP-TRAP (ChromoTek), zgodnie z protokołem producenta. Immunoprecypitaty eluowano przez gotowanie próbek w buforze Laemmli przez 5 minut. Białka zostały rozdzielone przez SDS-PAGE.

Immunofluorescencja

immunocytochemię przeprowadzono na komórkach wyhodowanych na pokrywach 22 × 22 mm. Komórki HeLa hodowano w stężeniu 70-80%, przemyto raz PBS, a następnie utrwalono za pomocą 4% w/v PFA przez 5-7 minut lub zimnego metanolu przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że ponieważ większość przeciwciał użytych w badaniu działała tylko po utrwaleniu PFA, próbki były zwykle utrwalane za pomocą 4% w/v PFA w PBS, o ile nie podano inaczej w legendach rysunkowych. PFA odrzucono zgodnie z przepisami bezpieczeństwa, a komórki przemyto trzykrotnie PBS. Komórki następnie przenikano za pomocą 0.5% v / V Triton X-100 przez 5-7 minut i przemyć trzy razy PBS w celu usunięcia resztek detergentu. Roztwór zawierający 1% w / v BSA dodano następnie do okładek, jako roztwór blokujący, w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania pierwotnych i wtórnych przeciwciał i przechowywano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór blokujący był odklejany z coverslips i pierwotne przeciwciała w odpowiednich rozcieńczeniach były dodawane do coverslips. Pokrywy z pierwotnymi przeciwciałami inkubowano w temperaturze 4 °C przez 16-20 godzin w wilgotnej i wilgotnej komorze. Następnie nakrywki przemyto trzy razy PBS i inkubowano z roztworem zawierającym przeciwciała wtórne przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (Należy zauważyć, że pierwotne i wtórne roztwory przeciwciał zostały wytworzone w buforze blokującym.) Rozcieńczenie drugorzędowych przeciwciał stosowanych w tym badaniu wynosiło 1: 400 wytworzonych w 1% wagowych roztworu BSA. Na koniec nakrywki zostały dwukrotnie przemyte PBS i sterylną wodą o wysokiej czystości i zamontowane na szkiełkach za pomocą medium montażowego Pro-Long gold anti-Fade dapi (Invitrogen, US). Szkiełka pokryw zostały następnie zobrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss Lsm880 lub LSM780 przy użyciu obiektywu zanurzeniowego 63x.

obrazowanie żywych komórek

komórki nokautujące ATG16L1 zostały zaszczepione do naczyń MatTek (MatTek, Ashland MA USA). Następnego dnia komórki te transfekowano odpowiednim plazmidem w oparciu o wymagania doświadczalne przy użyciu odczynnika do transfekcji Mirus Trans-it 2020. Transfekcję przeprowadzono przy użyciu medium optiMEM, przy użyciu protokołu producenta. Następnie zastosowano 2% roztwór podstawowy Triton X-100, aby osiągnąć wyznaczone stężenie do ekstrakcji detergentu z błony plazmatycznej. Końcowe stężenie 1% Triton X-100 jest zdolne do ekstrakcji cytozolicznego i związanego z błoną. Eksperyment potwierdzający obecność agregatów p62 w komórkach nokautujących ATG16L1 obejmował jednak ekstrakcję detergentu przy użyciu 1,5% Triton X-100 jako końcowego stężenia, aby poddać komórki surowszym Warunkom ekstrakcji. Następnie obrazowanie wykonano za pomocą modułu „szeregów czasowych” na inkubowanym mikroskopie Zeiss AxioObserver Z1 z mikroskopem konfokalnym LSM780 przy użyciu soczewki olejowo-zanurzeniowej 63 × 1,4 Na Plan Apochromat.

mikroskopia o Superrozdzielczej rozdzielczości

próbki wysiewano na Zeiss High precision No 1.5 170+ lub -5 µm, pokrywy 18 mm × 18 mm. Po wybarwieniu próbki zostały zamontowane w Pro-Long gold anti-fade mounting medium dapi (Life Technologies) i pozostawione do utwardzenia przez 3 dni, aby osiągnąć stały współczynnik załamania światła (Ri) wynoszący 1,46. Próbki zostały zobrazowane za pomocą strukturalnego oświetlenia na Elyrze PS1 (mikroskopia Carla Zeissa). Po wyrównaniu etapu, linie laserowe o długości 405, 488 i 561 nm zostały użyte do obrazowania stosu kulek w celu skorygowania aberracji chromatycznej za pomocą algorytmu wyrównania kanałów. Stosy Z zostały pozyskane przy 5 fazach i 5 obrotach siatki oświetleniowej, a następnie przetworzone i wyrównane za pomocą oprogramowania Zen Black Elyra edition (Carl Zeiss Microscopy).

ekstrakcja frakcji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych

ekstrakcję frakcji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych z komórek nokautujących ATG16L1 przeprowadzono w buforze RIPA. Krótko mówiąc, komórki przemyto raz 1x zimnym lodem PBS i zeskrobano, lizowano w 500 µl buforu RIPA i zebrano w oznakowanych probówkach trzymanych w lodzie. Skład buforu RIPA wyglądał następująco-

bufor RIPA

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% dezoksycholan sodu

0.1% SDS

w czasie stosowania bufor RIPA uzupełniono kompletną tabletką inhibitora proteazy (1 tabletka na 50 ml) oraz koktajlami inhibitora fosfatazy 2 i 3 (Po 1:100).

lizaty następnie przepuszczono przez igłę 25 G 10 razy, a następnie roztwór odwirowano przy 14000 obr. / min przez 15 minut w temperaturze 4 °C. po odwirowaniu supernatant zebrano w świeżej probówce Eppendorfa i oznakowano jako frakcję rozpuszczalną i zmieszano z 300 µl buforu 2x Laemmli i gotowano przez 5 minut. Osad otrzymany po odwirowaniu składa się z frakcji nierozpuszczalnej i ponownie zawieszono i przemyto 500 µl buforu RIPA. Następnie odwirowano wymieszany roztwór z prędkością 14000 obr. / min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. supernatant odrzucono i osad ponownie zawieszono w 100 µl buforu mocznika + RIPA. Następnie mieszano go ze 100 µl buforu 2x Laemmli i gotowano przez 5 minut. Kompozycja mocznika + buforu RIPA składa się z dodatkowego mocznika w końcowym stężeniu 2 M wraz ze składnikami buforu RIPA.

Western blot

komórki hodowane w 6-studzienkowych płytkach lizowano i zebrano w 2x buforze Laemmli (4% wagowych SDS, 20% wagowych glicerolu, 10% wagowych 2-merkaptoetanolu, 0,004% wagowych bromofenolu niebieskiego i 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Po lizie komórek, 20-30 µl próbek załadowano na 10-studzienkową, 12-15% SDS-PAGE i przeprowadzono przy napięciu 100-120 V. standardową drabinkę MW załadowano wraz z próbkami, aby śledzić ruch białek w żelu. Następnie białka przenoszono na aktywowany PVDF pod napięciem 100 V przez 60 minut. Błonę usunięto po zakończeniu transferu i moczono w 5% M/v odtłuszczonego mleka w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie do membrany dodano roztwór zawierający specyficzne przeciwciało pierwotne (wytworzone w 5% wagowych odtłuszczonego mleka) w odpowiednim rozcieńczeniu w celu nocnej inkubacji w temperaturze 4 °C. Następnie membrany przemyto trzykrotnie pbst (bufor fosforanowy +0,1% Tween-20) przed dodaniem przeciwciała wtórnego. Przeciwciało wtórne, również wytworzone w 5% M/v odtłuszczonego mleka, inkubowano z błoną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczenie przeciwciała wtórnego utrzymywano na ogół w stosunku 1:4000 dla przeciwciał sprzężonych z Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP i 1: 5000 dla przeciwciał sprzężonych z FLUOROFOREM LICORU. Membrany były następnie wielokrotnie przemywane PBST i opracowywane przy użyciu mieszaniny równych objętości opracowywanych roztworów 1 i 2 dla ECL lub obrazowane bezpośrednio do wykrywania sygnału fluorescencji za pomocą oprogramowania LICOR Image Studio (LICOR, US).

CRISPR knockout cell generation

guide RNA zostały zaprojektowane do generowania komórek knockout ATG9 przy użyciu narzędzia online opracowanego przez Zhang Lab21. Pierwsze trzy pojedyncze naprowadzające RNA (sgRNA) modyfikowano ręcznie, aby dodać miejsca restrykcyjne BbsI, a te sekwencje sgRNA o odsalonej czystości uporządkowano z Invitrogenu. Sekwencja użyta z powodzeniem do nokautu ATG9 CRISPR była:

zaznaczone nukleotydy wskazują na dodane nawisy. Następnie sgRNA ligowano w kręgosłupie pskas9-2A-puromycyny. Pomyślnie ligowane plazmidy lub pusta Kontrola wektora Cas9 transfekowano następnie w komórkach HeLa i ekspresję pozwalano na 24 godziny. Następnie wyselekcjonowano transfekowane komórki, dodając do nich puromycynę w końcowym stężeniu 2-4 µg / ml. Komórki mogły rosnąć, aż wszystkie Nie transfekowane komórki były martwe. Komórki dodatnie następnie trypsynizowano, a liczbę komórek oceniano za pomocą szkiełek Inwitrogenowych (10 µl jednorodnej zawiesiny komórkowej +10 µl Trypanu niebieskiego). W oparciu o populację żywych komórek, komórki 0,2 × 104 zasysano i seryjnie rozcieńczano w 96-studzienkowej płytce w celu uzyskania pojedynczych Kolonii komórkowych. Rozcieńczenie seryjne zawsze wynosiło 1:1 i końcową objętość w każdej studzience na końcu rozcieńczenia utrzymywano do 200 µl. Lizaty komórkowe następnie ładowano na SDS-PAGE, przenoszono do membrany w celu sprawdzenia wybicia ATG9.

kwantyfikacja danych i analiza statystyczna

obrazy były kwantyfikowane przy użyciu domyślnej wtyczki 'Analyze particles’ w ImageJ. Dodatkowo zidentyfikowano wspólnie zlokalizowane piksele i wygenerowano profil przy użyciu algorytmu wtyczki ImageJ o nazwie „kolokalizacja”, który został opracowany przez Pierre 'a Bourdoncle’ a (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paryż; 2003–2004). Western blots zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania LICOR Image Studio (LICOR, US), A wartości zostały przetworzone, przeanalizowane i wykreślone za pomocą programu Excel z pakietu Microsoft Office.

poziomy istotności statystycznej dla porównań między dwiema grupami oszacowano za pomocą jednoogonowych lub dwuogonowych testów T. W przypadku eksperymentu z udziałem ATG7 i ATG10 kd do oceny istotności statystycznej danych wykorzystano test T z jednym ogonem. W przypadku wszystkich innych eksperymentów w tym badaniu zastosowano dwuogonowy test t do oceny istotności statystycznej danych. W niniejszej pracy wartość p < 0,05 została uznana za statystycznie istotną, a konwencje użyte do przedstawienia wyników w tym artykule są następujące: *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001 i paski błędów reprezentują odchylenia standardowe, o ile nie wskazano inaczej.