Calmodulin

Calmodulin Interacțiuni cu Ca2+ și cu NOS

CaM este o proteină mică de legare a Ca2+(greutate moleculară 17 kDa) formată din doi lobi globulari similari conectați printr-o regiune centrală de legătură. Fiecare lob conține două mâini E–F care includ o helix n-terminal (e helix), o buclă de coordonare Ca2+ situată central și o helix C-terminal (F helix) (domeniile CaM sunt în general etichetate ca 1-4 de la N la C terminal). La legarea Ca2+, CaM este capabil să se lege și să activeze mai mult de 30 de enzime țintă, permițându-i să regleze numeroși mesageri secundari și funcții celulare. Legarea și activarea completă a proteinelor țintă de către CaM necesită de obicei ocuparea tuturor celor patru situsuri de legare Ca2+în CaM. Lobul carboxi-terminal conține două situsuri de legare Ca2 + cu afinitate ridicată, în timp ce lobul amino-terminal conține două situsuri cu afinitate Ca2+ mai mică. Modificările conformaționale apar în CaM după ce se leagă Ca2+: reziduurile de suprafață hidrofobe devin expuse pentru a forma interacțiuni cruciale van der Waals cu fața hidrofobă a site-ului de recunoaștere a peptidelor țintă.

CaM se leagă de fiecare subunitate NOS într-o stoichiometrie 1:1 cu afinitate rezonabil de mare. Studiile de afinitate de legare cu peptide care corespund secvențelor de recunoaștere NOS CaM arată că cele trei nos prezintă afinități diferite față de CaM, ordinea generală fiind NOS inductibil de citokine (inos) nos neuronal (nNOS) nos endotelial (eNOS). Peptida iNOS se leagă bine de CaM atât în prezența, cât și în absența Ca2+, dar peptidele eNOS și nNOS se leagă de CaM numai în prezența Ca2+.

fiecare lob de CaM se leagă independent de NOS și prezintă afinități diferite față de NOS. interacțiunea CaM–nNOS a fost investigată folosind mutanți CaM și proteine cam vegetale. nNOS prezintă un grad ridicat de specificitate structurală față de domeniile CaM 1, 3 și, eventual, 4 în ceea ce privește activarea reducerii hemului și fără sinteză. Interacțiunile CaM-nNOS sunt deosebit de importante pentru transferul de electroni și implică regiunea de blocare a CaM (formată din domeniile CaM 1 și 3) și un reziduu de metionină în domeniul 4. Aceste regiuni ale CaM par să interacționeze cu regiuni încă necunoscute pe NNO-uri care sunt distincte de secvența sa canonică de legare a camelor. Sarcina și lungimea linkerului central se constată, de asemenea, că afectează legarea și activarea iNOS prin interacțiunea electrostatică în linkerul central și interacțiunile hidrofobe din domeniul globular al CaM, care pare responsabil pentru asocierea sa strânsă cu iNOS. Disocierea Ca2+ de la nos-legat CaM are loc în două etape secvențiale: disocierea rapidă Ca2+ de la lobul n-terminal are loc mai întâi și corespunde cu inactivarea sintezei NO, urmată de o disociere mai lentă Ca2 + de la lobul C-terminal, ceea ce duce la disocierea CaM de la NOS. Modificările conformaționale apar în peptidele care leagă NOS CaM atunci când leagă CaM. În mod tipic, peptidele dobândesc o conformație elicoidală-spirală la interacțiunea cu camul legat de Ca2+. O modificare conformațională indusă de CaM în domeniul reductazei NOS apare, de asemenea, așa cum este indicat de modificările fluorescenței proteinelor și flavinei și de o modificare a modelului proteolizei tripsinei.

este disponibilă o structură cristalografică a CaM-ului încărcat cu Ca2+legat de o peptidă cu 20 de reziduuri corespunzătoare secvenței de recunoaștere a CaM-ului eNOS. Structura a relevat faptul că peptida Enos elicoidal-elicoidal se leagă de CaM într-o orientare antiparalelă prin interacțiuni hidrofobe extinse: lobii n-terminali și C – terminali ai CaM se înfășoară în jurul peptidei legate, interacționând cu jumătățile C-și n-terminale ale peptidei, respectiv. Reziduurile CaM specifice din regiunea zăvorului și domeniul 4 au fost poziționate într-o manieră compatibilă cu importanța lor determinată de studiile de mutageneză. Structura cristalină a sugerat, de asemenea, o bază pentru legarea mai strânsă a camelor în iNOS: deoarece iNOS conține un număr mai mare de reziduuri hidrofobe în cadrul secvenței sale de recunoaștere cam corespunzătoare, s-a susținut că acestea ar susține contacte van der Waals mai extinse cu CaM și ar minimiza expunerea nefavorabilă la solvent a reziduurilor hidrofobe pentru a favoriza o asociere mai strânsă între cam și secvența de recunoaștere cam iNOS.

structura cristalină a unui complex între Ca2+/CaM și domeniul FMN al iNOS-urilor umane este de asemenea disponibilă. Patru conformații diferite au fost identificate în structura complexului, ceea ce demonstrează natura flexibilă a interacțiunilor Domeniu–domeniu CaM și FMN. O punte de sare formată între CaM și domeniul FMN este evidentă în structură și poate fi importantă pentru transducerea efectului legării CaM asupra funcțiilor NOS.