Calmodulin

calmodulin interaktioner med Ca2+ och med NOS

CaM är en liten Ca2+-bindande protein (molekylvikt 17 kDa) bestående av två liknande klotformiga lober förbundna med en central länkregion. Varje lob innehåller två E – F-händer som inkluderar en N-terminal helix (e helix), en centralt belägen Ca2+ koordinerande slinga och en C-terminal helix (F helix) (domäner av CaM är vanligtvis märkta som 1-4 från N till C terminal). Vid Ca2 + – bindning kan CaM binda till och aktivera mer än 30 målenzymer, vilket gör det möjligt att reglera många andra budbärare och cellfunktioner. Bindning och full aktivering av målproteiner av CaM kräver vanligtvis beläggning av alla fyra Ca2+-bindningsställen i CaM. Den karboxiterminala loben innehåller två Ca2+-bindningsställen med hög affinitet, medan den amino-terminala loben innehåller två platser med lägre Ca2+ affinitet. Konformationsförändringar inträffar i CaM efter att det binder Ca2+: hydrofoba ytrester exponeras för att bilda avgörande van der Waals-interaktioner med det hydrofoba ansiktet på målpeptidigenkänningsstället.

CaM binder till varje NOS-subenhet i en 1: 1 stökiometri med rimligt hög affinitet. Bindningsaffinitetsstudier med peptider som motsvarar nos CaM-igenkänningssekvenser visar att de tre NOSs uppvisar olika affiniteter mot CaM med den allmänna ordningen som cytokininducerbar nos (iNOS), neuronal nos (nNOS), endotel NOS (Enos). INOS-peptiden binder väl till CaM både i närvaro och frånvaro av Ca2+, men Enos-och nNOS-peptider binder till CaM endast i närvaro av Ca2+.

varje lob av CaM binder till NOS oberoende och visar olika affiniteter mot NOS. cam–nNOS-interaktionen har undersökts med hjälp av CaM-mutanter och växtkamproteiner. nNOS visar en hög grad av strukturell specificitet mot Kamdomäner 1, 3 och eventuellt 4 angående aktivering av hemreduktion och ingen syntes. Cam-nNOS-interaktionerna är särskilt viktiga för elektronöverföring och involverar spärrregionen av CaM (bildad av Kamdomäner 1 och 3) och en metioninrest i domän 4. Dessa regioner av CaM verkar interagera med ännu okända regioner på nNOS som skiljer sig från dess kanoniska Kambindande sekvens. Laddningen och längden på den centrala länken har också visat sig påverka bindningen och aktiveringen av iNOS genom elektrostatisk interaktion i den centrala länken och hydrofoba interaktioner i den globala domänen av CaM, som verkar ansvarig för dess snäva koppling till iNOS. Ca2 + dissociation från NOS-bunden kam sker i två sekventiella steg: snabb Ca2 + dissociation från N-terminal lob sker först och motsvarar inaktivering av NO-syntes, följt av en långsammare Ca2+ dissociation från C-terminal lob, vilket leder till dissociation av CaM från NOS. Konformationsförändringar inträffar i NOS CaM-bindande peptider när de binder CaM. Typiskt, peptiderna förvärva en bisexuell-spiralformad konformation vid interaktion med Ca2 + bunden kam. En CaM-inducerad konformationsförändring i nos-reduktasdomänen uppträder också som indikeras av förändringar i protein och flavinfluorescens och genom en förändring i trypsinproteolysmönstret.

en kristallografisk struktur av Ca2 + – laddad kam bunden till en 20-restpeptid motsvarande Enos CaM-igenkänningssekvensen är tillgänglig. Strukturen avslöjade att den kambodjanska spiralformade Enos-peptiden binder till CaM i en antiparallell orientering genom omfattande hydrofoba interaktioner: de N-terminala och C-terminala loberna av CaM lindas runt den bundna peptiden, interagerar med C – respektive N-terminala halvorna av peptiden. Specifika CaM-rester i spärrregionen och domän 4 placerades på ett sätt som överensstämmer med deras betydelse som bestäms av mutagenesstudier. Kristallstrukturen föreslog också en grund för stramare Kambindning i iNOS: eftersom iNOS innehåller ett större antal hydrofoba rester inom dess motsvarande kamigenkänningssekvens, hävdades det att dessa skulle stödja mer omfattande van der Waals-kontakter med CaM och minimera ogynnsam lösningsmedelsexponering av hydrofoba rester för att gynna tätare samband mellan CaM och iNOS CaM-igenkänningssekvensen.

kristallstrukturen hos ett komplex mellan Ca2 + / CaM och FMN-domänen för human iNOS är också tillgänglig. Fyra olika konformationer identifierades i komplexets struktur, vilket visar den flexibla naturen hos Cam–och FMN-domän-domäninteraktioner. En saltbro som bildas mellan CaM och FMN-domänen är uppenbar i strukturen och kan vara viktig för att omvandla effekten av Kambindning på NOS-funktioner.