LC3-positiva strukturer är framträdande i autofagi-bristfälliga celler

Material

antikropparna som används i denna studie är: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) och alla Alexa-konjugerade sekundära antikroppar köptes från Invitrogen. De pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A och RFP-LC3 konstruktioner var vänliga gåvor från Dr. T. Yoshimori (Osaka University, Japan). ATG9A-pEGFP var en snäll gåva från Dr Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry var från Clontech (632524), mCherry-p62 och mCherry-p62 LIR mutant (DDDW335-338AAAA) var en snäll gåva från Dr. Sascha Martens (University of Vienna, Österrike), p62-pEGFP var en snäll gåva från Dr. Terje Johansen (Artic University, Norge), medan Myc-LC3-G120A-EXPORC22 var en gåva från Dr.T. Yoshimori (Addgene plasmid # 45449). PSpCas9 (BB)-2a-Puro (PX459) V2.0 var en gåva från Dr.F. Zhang (Addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 var en snäll gåva från Dr.Isei Tanida. EGFP-LC3K51A och EGFP-LC3F52A skapades av platsmutagenes med hjälp av Q5-Platsstyrd mutagenes kit (NEB E0554S) och pEGFP-LC3 som en mall enligt tillverkarens instruktioner. Primers som används för k51a-mutationen: 5 ’- ccgtcctggacaagaccgcgttttgtacctgatc-3 ’ och för f52a-mutationen: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

cellodling

HeLa-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% v/v fetalt bovint serum, 100 U/ml penicillin-streptomycin och 2 mM L-glutamin. HepG2-celler bibehölls i rpmi 1640-medium kompletterat med 10% v/v fetalt bovint serum, 100 U/ml penicillin-streptomycin, alla erhållna från Sigma, UK. Cellinjerna upprätthölls genom att passera cellerna med användning av Trypsin-EDTA-lösning (Sigma), efter att de är sub-confluent till cirka 75-90% i T75 (75 cm2-området) kolvar (Falcon). Cellinjen som användes för denna studie var HeLa (Human cervical cancer cells) cellinje. I experiment där vi behövde blockera autofagiskt flöde behandlades celler med 400 nM bafilomycin A1 i 4 timmar vid 37 kcal C.

transfektion

HeLa-cellerna transfekterades med den renade plasmiden med hjälp av mirus TransIT-2020 transfektionsreagens. Transfektionen utfördes med användning av optiMEM medium, med användning av tillverkarens protokoll. I korthet framställdes en blandning av 100 oc optiMEM med 1 oc DNA och inkuberades vid rumstemperatur i 5 minuter. En annan blandning innehållande 100 oc optiMEM med 5 oc mirus framställdes och inkuberades i 5 minuter. Båda lösningarna blandades sedan ihop och inkuberades i ungefär 20-25 minuter. Den totala volymen tillsattes sedan till en brunn av en 6-brunnsplatta, som redan innehöll 1 ml optiMEM. Mängden DNA som i allmänhet användes för transfektion var 1 kg för en 6-brunn.

siRNA-medierad knockdown

cellerna för siRNA-knockdown transfekterades med lipofektamin 2000 transfektionsreagens. Transfektionen utfördes med användning av optiMEM medium, med användning av tillverkarens protokoll. I korthet framställdes en blandning av 100 oc optiMEM med 3 oc 20 oC eller 1 oc 100 oc siRNA och inkuberades vid rumstemperatur i 5 minuter. Samtidigt framställdes och inkuberades en annan blandning innehållande 100 UKL optiMEM med 5 UKL Lipofektamin 2000 i 5 minuter. Båda lösningarna blandades sedan ihop och inkuberades i ungefär 20-25 minuter. Den totala volymen tillsattes sedan till en brunn av en 6-brunnsplatta, som redan innehöll 1 ml optiMEM i 4 timmar vid 37 kcal C. Efter inkubationen ändrades media och ersattes med full media. Cellerna skördades sedan efter 48 timmars inkubation om en enda knockdown (KD) önskades, som för ATG7 och ATG10 KD i HeLa-celler. För atg7 och ATG10 räddningsexperiment, en pcDNA.3 (tom vektor) eller ATG7 plus ATG10-flagga användes för att transfektera celler 24 timmar efter siRNA-transfektionen. För dubbla KD-studier utförde vi ytterligare en omgång av siRNA-transfektion, enligt samma protokoll som nämnts ovan, efter den första omgången (för p62 KD-studier). För siRNA knockdown i HepG2-celler transfekterades dessa med Lipofektamin RNAi max transfektionsreagens med användning av 100 nM slutlig siRNA och två omgångar av siRNA transfektion utfördes för att uppnå en effektiv knockdown. Celler delades sedan upp och såddes till respektive plattor eller täckglas för ytterligare experiment. Den förvrängda siRNA (on-TARGETplus icke-targeting Pool, D-001810-10), human ON-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), human ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) beställdes från Dharmacon och användes vid en slutlig koncentration av 50-100 nM.

GFP-trap-analyser

HeLa-celler transfekterades med EGFP-LC3 med användning av Mirus TransIT-2020 transfektionsreagens och 24 timmar senare lyserades i lysbuffert (50 mm HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) i 10 min på is och pelleteras i 10 min vid 13 000 rpm. GFP-märkta proteiner (EGFP eller EGFP-LC3) drogs ner med GFP-FÄLLPÄRLOR (ChromoTek), enligt tillverkarens protokoll. Immunoprecipitates eluerades, genom att koka proverna i laemmlibufferten för 5 min. Proteiner löstes av SDS-PAGE.

immunofluorescens

immunocytokemin utfördes på celler odlade på 22 kcal 22 mm täckglas. HeLa-celler odlades vid en sammanflöde av 70-80%, tvättades en gång med PBS och fixerades sedan antingen med 4% w/v PFA i 5-7 minuter eller kallmetanol i 3-5 minuter vid 4 kg C. Observera att eftersom de flesta antikroppar som användes i studien endast fungerade vid PFA-fixering fixerades proverna i allmänhet med 4% w/v PFA i PBS om inte annat nämns i figurlegenden(erna). PFA kastades i enlighet med säkerhetsbestämmelserna och cellerna tvättades tre gånger med PBS. Cellerna permeabiliserades sedan med 0.5% v/v Triton X – 100 i 5-7 minuter och tvättas tre gånger med PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande tvättmedel. En lösning innehållande 1% BSA sattes sedan till täckglasen, som en blockerande lösning, för att minska den icke-specifika bindningen av de primära och sekundära antikropparna och hölls i 1 timme vid rumstemperatur. Den blockerande lösningen tappades sedan av täckglasen och de primära antikropparna vid lämpliga utspädningar tillsattes på täckglasen. Täckglasen med primära antikroppar inkuberades vid 4 kg C i 16-20 timmar i en fuktig och fuktig kammare. Täckglasen tvättades därefter tre gånger med PBS och inkuberades med en lösning innehållande sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur. (Observera att de primära och sekundära antikroppslösningarna gjordes i blockeringsbufferten.) Utspädningen av de sekundära antikropparna som användes för denna studie var 1:400 beredda i 1% w/v BSA-lösning. Slutligen tvättades täckglas två gånger med PBS och sterilt vatten med hög renhet och monterades på glasskivor med Pro-Long gold anti-fade DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). Täckglasen avbildades sedan med Zeiss LSM880 eller LSM780 konfokalt mikroskop med 63x oljedämpningsmål.

levande cellavbildning

ATG16L1-knockout-celler såddes på MatTek-rätterna (MatTek, Ashland MA USA). Följande dag transfekterades dessa celler med lämplig plasmid baserat på experimentella krav med användning av Mirus Trans-IT 2020 transfektionsreagens. Transfektionen utfördes med användning av optiMEM medium, med användning av tillverkarens protokoll. En 2% Triton X-100 stamlösning användes sedan för att nå den angivna koncentrationen för tvättmedelsextraktion av plasmamembranet. En slutlig koncentration av 1% Triton X-100 kan extrahera den cytosoliska och membranbundna. Experimentet för att bekräfta närvaron av p62-aggregat i ATG16L1-knockout-celler involverade emellertid tvättmedelsextraktion med användning av 1,5% Triton X-100 som den slutliga koncentrationen för att utsätta cellerna för hårdare extraktionsförhållanden. Avbildning utfördes sedan med hjälp av’ Tidsseriemodulen ’ på ett inkuberat Zeiss AxioObserver Z1-mikroskop med ett lsm780 konfokalt mikroskop med användning av en 63 1.4 na-plan för apokromatolje-nedsänkningslins.

superupplösningsmikroskopi

proverna såddes på Zeiss hög precision nr 1,5 170+ eller -5 okt, 18 mm okt 18 mm täckglas. Efter färgning monterades proverna i Pro-Long gold anti-fade DAPI monteringsmedium (Life Technologies) och lämnades att härda i 3 dagar för att nå ett konstant brytningsindex (RI) på 1,46. Prover avbildades med strukturerad belysning på Elyra PS1 (Carl Zeiss-mikroskopi). Efter stegjustering användes laserlinjer av 405, 488 och 561 nm för att avbilda en pärlstack för att korrigera för kromatisk aberration med hjälp av kanalljusteringsalgoritmen. Z-stackar förvärvades vid 5-faser och 5-rotationer av belysningsnätet och bearbetades och anpassades därefter med hjälp av ZEN Black elyra edition-programvaran (Carl Zeiss-mikroskopi).

extraktion av lösliga och olösliga fraktioner

extraktionen av de lösliga och olösliga fraktionerna från ATG16L1-knockout-celler utfördes i RIPA-buffert. I korthet tvättades cellerna med 1X iskalla PBS en gång och skrapades, lyserades i 500 oc Ripa-buffert och samlades i märkta rör som hölls på is. Sammansättningen av RIPA-buffert var som följer –

RIPA-buffert

50 mM Tris-HCl (pH 7, 4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Natriumdeoxikolat

0.1% SDS

vid tidpunkten för användning kompletterades RIPA-buffert med komplett proteashämmare tablett (1 tablett per 50 ml) och fosfatashämmare cocktails 2 och 3 (1:100 vardera).

lysaterna passerades sedan genom en 25 G nål 10 gånger och sedan centrifugerades lösningen vid 14000 rpm i 15 minuter vid 4 kg C. efter centrifugering uppsamlades supernatanten i ett nytt Eppendorf-rör och märktes som den lösliga fraktionen och blandades med 300 kg 2x Laemmli-buffert och kokades i 5 minuter. Pelleten erhållen efter centrifugering består av den olösliga fraktionen och resuspenderades och tvättades med 500 occyls RIPA-buffert. Den resuspenderade lösningen centrifugerades sedan vid 14000 rpm i 5 minuter vid 4 kcal C. supernatanten kasserades och pelleten resuspenderades i 100 kg UREA + RIPA-buffert. Detta blandades slutligen med 100 oc 2x Laemmli buffert och kokades i 5 minuter. Sammansättningen av UREA + RIPA-buffert består av ytterligare Urea vid en slutlig koncentration av 2 M tillsammans med komponenterna i RIPA-buffert.

Western blot

celler odlade i 6-brunnsplattor lyserades och samlades i 2x Laemmli-buffert (4% w/v SDS, 20% V/V glycerol, 10% v/v 2-merkaptoetanol, 0,004% w/v bromfenolblått och 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Efter att cellerna lysades, laddades 20-30 oc av proverna på en 10-brunn, 12-15% SDS-sida och kördes vid 100-120 V. en standard MW-stege laddades tillsammans med proverna för att hålla reda på rörelsen av proteinerna i gelen. Proteinerna överfördes sedan till den aktiverade PVDF vid 100 V i 60 minuter. Membranet avlägsnades efter avslutad överföring och blöts i 5% W/v skummjölk för att blockera icke-specifika bindningsställen under 1 timme vid rumstemperatur. Därefter tillsattes en lösning innehållande specifik primär antikropp (framställd i 5% W/v skummjölk) vid en lämplig utspädning till membranet för inkubation över natten vid 4 msk C. membranen tvättades sedan tre gånger med PBST (fosfatbuffert saltlösning +0,1% Tween-20) före tillsats av sekundär antikropp. Den sekundära antikroppen, som också framställdes i 5% W / v skummjölk, inkuberades med membranet i 1 timme vid rumstemperatur. Utspädningen av den sekundära antikroppen hölls i allmänhet vid 1:4000 för förbättrad kemiluminescens (ECL) HRP-konjugerade antikroppar och 1: 5000 för LICOR fluorofor-konjugerade antikroppar. Membranen tvättades sedan igen med PBST flera gånger och utvecklades med användning av en blandning av lika stora volymer av att utveckla lösningar 1 och 2 för ECL eller avbildas direkt för fluorescenssignaldetektering med hjälp av LICOR Image Studio-programvara (LICOR, USA).

CRISPR knockout cell generation

guiden rna var utformade för generering av ATG9 knockout celler med hjälp av online-verktyg som utvecklats av Zhang Lab21. De tre bästa single guide RNA (sgRNA) – träffarna modifierades manuellt för att lägga till BbsI-begränsningsställen och dessa sgRNA-sekvenser av avsaltad renhet beställdes från Invitrogen. Sekvensen som framgångsrikt användes för ATG9 CRISPR knockout var:

de markerade nukleotiderna indikerar de tillsatta överhängen. SgRNA ligerades sedan i ryggraden psCas9-2a-putromycin. De framgångsrikt ligerade plasmiderna eller tomma Cas9-vektorkontrollen transfekterades sedan i HeLa-celler och uttrycket tilläts i 24 timmar. Transfekterade celler valdes sedan genom tillsats av putromycin till cellerna vid en slutlig koncentration av 2-4 occurg/ml. Celler fick växa tills alla icke-transfekterade celler var döda. De positiva cellerna trypsiniserades sedan och cellantalet bedömdes med användning av Invitrogen grevinnan glider (10 oc h homogen cellsuspension +10 oc h Trypanblått). Baserat på den levande cellpopulationen aspirerades 0,2 104-celler i 104-celler och späddes seriellt i en 96-brunnsplatta för att erhålla enstaka cellkolonier. Den seriella utspädningen var alltid 1:1 och den slutliga volymen i varje brunn i slutet av utspädningen hölls till 200 oc.l. Celllysaterna laddades sedan på SDS-sida, överfördes till ett membran för att kontrollera att ATG9 slogs ut.

kvantifiering av data och statistisk analys

bilderna kvantifierades med standardinsticksprogrammet ’analysera partiklar’ i ImageJ. Dessutom identifierades de samlokaliserade pixlarna och en profil genererades med hjälp av en oövervakad ImageJ-plugin-algoritm som heter ’colocalization’, som utvecklades av Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). Western blots kvantifierades med hjälp av Licor Image Studio-programvaran (LICOR, USA) och värdena bearbetades, analyserades och plottades med Excel-program från Microsoft Office-sviten.

de statistiska signifikansnivåerna för jämförelser mellan två grupper uppskattades med hjälp av en-tailed eller två-tailed t-test. För experimentet med ATG7 och ATG10 KD användes ett-tailed t-test för att bedöma den statistiska signifikansen av data. För alla andra experiment i denna studie användes ett två-tailed t-test för att bedöma den statistiska signifikansen av data. I detta dokument ansågs värdet på p < 0,05 vara statistiskt signifikant och de konventioner som används för att skildra resultaten i denna artikel är följande: *p 0,05; **p 0,01; ***p 0,001 och Felfält representerar standardavvikelser om inte annat nämns.