Calmodulin

Calmodulin interaktioner med Ca2+ og med NOS

CaM er et lille Ca2+-bindende protein (molekylvægt 17 kDa) bestående af to lignende kugleformede lobes forbundet med en central linker region. Hver lap indeholder to E-F hænder, der inkluderer en N-terminal spiral (e spiral), en centralt placeret Ca2+ koordinerende sløjfe og en C-terminal spiral (f spiral) (domæner af CaM er generelt mærket som 1-4 fra N til C terminal). Ved Ca2+ binding er CaM i stand til at binde til og aktivere mere end 30 målgrupper, hvilket gør det muligt at regulere adskillige andre budbringere og cellefunktioner. Binding og fuld aktivering af målproteiner med CaM kræver typisk belægning af alle fire Ca2+-bindingssteder i CaM. Den carboksyterminale lap indeholder to Ca2+-bindingssteder med høj affinitet, mens den amino-terminale lap indeholder to steder med lavere Ca2+ affinitet. Konformationsændringer forekommer i CaM, efter at det binder Ca2+: hydrofobe overfladerester bliver eksponeret for at danne afgørende Van Der-interaktioner med det hydrofobe ansigt på målpeptidgenkendelsesstedet.

CaM binder til hver NOS-underenhed i en 1:1 støkiometri med rimelig høj affinitet. Bindingsaffinitetsstudier med peptider, der svarer til NOS-cam-genkendelsessekvenser, viser, at de tre nos ‘ er viser forskellige affiniteter mod CaM, hvor den generelle orden er cytokininducible NOS (Inos) – neuronal nos (nNOS) – endotelnos (Enos). INOS-peptidet binder godt til CaM både i nærvær og fravær af Ca2+, men Enos-og nNOS-peptider binder kun til CaM i nærvær af Ca2+.

hver lap af CaM binder til NOS uafhængigt og viser forskellige affiniteter mod NOS. CaM–nNOS interaktionen er blevet undersøgt ved hjælp af CaM mutanter og plant CaM proteiner. nno ‘ er viser en høj grad af strukturel specificitet over for CaM-domæner 1, 3 og muligvis 4 vedrørende aktivering af hæmreduktion og ingen syntese. Cam-nNOS-interaktionerne er især vigtige for elektronoverførsel og involverer låseområdet for CaM (dannet af CaM-domæner 1 og 3) og en methioninrest i domæne 4. Disse regioner af CaM ser ud til at interagere med endnu ukendte regioner på nno ‘ er, der adskiller sig fra dens kanoniske CaM-bindende sekvens. Ladningen og længden af den centrale linker viser sig også at påvirke bindingen og aktiveringen af iNOS gennem elektrostatisk interaktion i den centrale linker og hydrofobe interaktioner i det kugleformede domæne af CaM, som synes ansvarlig for dens stramme tilknytning til iNOS. Ca2 + dissociation fra NOS-bundet CaM forekommer i to sekventielle trin: hurtig Ca2+ dissociation fra Den N-terminale lap forekommer først og svarer til inaktivering af NO-syntese efterfulgt af en langsommere Ca2+ dissociation fra Den C-terminale lap, hvilket fører til dissociation af CaM fra NOS. Konformationsændringer forekommer i NOS CaM-bindende peptider, når de binder CaM. Typisk får peptiderne en kur-spiralformet konformation ved interaktion med Ca2+ bundet CaM. En CaM-induceret konformationsændring i NOS-reduktasedomænet forekommer også som indikeret ved ændringer i protein-og flavinfluorescens og ved en ændring i trypsinproteolysemønsteret.

en krystallografisk struktur af Ca2+-loaded CaM bundet til et 20-restpeptid svarende til Enos CaM-genkendelsessekvensen er tilgængelig. Strukturen afslørede, at det Krish-spiralformede Enos-peptid binder til CaM i en antiparallel orientering gennem omfattende hydrofobe interaktioner: De N-terminale og C – terminale lobes af CaM vikles rundt om det bundne peptid og interagerer med henholdsvis C-og N-terminale halvdele af peptidet. Specifikke CaM-rester i låseområdet og domæne 4 blev placeret på en måde, der var i overensstemmelse med deres betydning som bestemt ved mutagenesestudier. Krystalstrukturen foreslog også et grundlag for strammere CaM-binding i iNOS: fordi iNOS indeholder et større antal hydrofobe rester inden for dens tilsvarende CaM-genkendelsessekvens, blev det hævdet, at disse ville understøtte mere omfattende van der-kontakter med CaM og minimere ugunstig opløsningsmiddeleksponering af hydrofobe rester for at favorisere en strammere sammenhæng mellem CaM og iNOS CaM-genkendelsessekvensen.

krystalstrukturen i et kompleks mellem Ca2+/CaM og FMN-domænet for menneskelige iNOS er også tilgængeligt. Fire forskellige konformationer blev identificeret i kompleksets struktur, hvilket demonstrerer den fleksible karakter af Cam–og FMN-domænedomæneinteraktioner. En saltbro dannet mellem CaM og FMN-domænet er tydelig i strukturen og kan være vigtig for at transducere effekten af CaM-binding på nos-funktioner.