Charakterizace slizniční lymfoidní agregáty v ulcerózní kolitidy: fenotyp imunitních buněk a TcR-γδ výraz | Gut

Výsledky

LEUKOCYTY PŘEDSTAVUJÍ HLAVNÍ TYP BUNĚK DO ZANÍCENÉ UC tlustého STŘEVA A DISTRIBUOVAT JINAK V SLIZNICE TLUSTÉHO střeva UC PACIENTŮ ve SROVNÁNÍ S ovládacími prvky

Dvanáct vzorků zánět sigmatu z UC pacientů a 15 vzorků zřejmě normální esovité kličky od pacientů bez historie IBD byly podrobeny fenotypová analýza imunohistochemie. Devět z těchto vzorků UC bylo klasifikováno jako těžce nemocné. V nich byl epitel zploštěn sníženým počtem pohárkových buněk, rozvětvené krypty, a příležitostné ulcerace. Kryptové abscesy byly běžné. Lamina propria obsahovala četné rozptýlené leukocyty i bazální lymfoidní agregáty (obr. 1A). Tři vzorky UC byly klasifikovány jako středně nemocné. Ve všech epitelu byl neporušený s mírně sníženým počtem pohárkových buněk a žádné / několik rozvětvených krypt. Lamina propria obsahovala zvýšený počet leukocytů a byly přítomny lymfoidní agregáty. Morfometrická analýza byla zaměřena na agregáty.

agregáty tvořily nodulární fúzující shluky lymfocytů bez typických reaktivních Center. Byly umístěny mezi základnami krypt a submukózy bez zjevného kontaktu s luminálním epitelem (obr. Nicméně byla často zaznamenána těsná blízkost mezi buňkami v agregátech a kryptovým epitelem (obr. 1A, D). Frekvence agregátů (počet / plocha) byla podobná u středně a těžce nemocné tkáně, v rozmezí od 1,3 do 4,9 agregátů na mm2 lamina propria (tabulka 3). Nicméně, oblast lamina propria obsazené agregátů se zvyšuje s závažnosti onemocnění a představuje až 45% lamina propria v závažných onemocněních tlustého střeva od některých pacientů (tabulka 3). Normální solitární folikuly v kontrolním tlustém střevě byly vzácné (méně než 0, 1 folikulu/mm2 lamina propria, n=8).

Přibližně 75% buněk v agregátech byly leukocytů (74 (7)% průkazu cd45+ buněk (n = 9)). Podíl leukocytů v solitárních lymfoidních folikulech byl také vysoký (67 (6)% CD45 + buněk (n=8)). Obě hodnoty mohou být podceňovány, protože barvení anti-CD45 mAb bylo heterogenní. Toto heterogenní barvení může být vysvětleno, alespoň částečně, sníženou expresí CD45 na aktivovaných B buňkách.

počet leukocytů a to jak v lamina propria mimo agregáty (26 (7)% průkazu cd45+ buněk (n=4)) a do submukózy (8 (2)% průkazu cd45+ buněk (n=4)) byla zvýšena v UC tlustého střeva ve srovnání s normální tlustého střeva (15 (2)% průkazu cd45+ buněk v lamina propria mimo folikuly a 4 (2)% průkazu cd45+buněk v submukóze (n=4)).

intraepiteliální leukocyty byly přítomny v nižších frekvencích v UC tlustém střevě ve srovnání s normálním tlustým střevem: 28 (7) CD45 + buněk / 1000 epiteliálních buněk v těžce nemocné tkáni tlustého střeva (n=4)ve srovnání s 66 (26) CD45+ buněk / 1000 epiteliálních buněk v kontrolách (n=4, p=0,03). IEL byly detekovány hlavně v kryptálním epitelu v UC tlustém střevě, částečně kvůli erozi luminálního povrchového epitelu. V normálním tlustém střevě bylo >60% IEL umístěno v luminálním epitelu. Tak jako hustota IEL je nižší v cryptal, než v luminální epitelu v normální tlustého střeva na nižší frekvenci IEL v UC tlustého střeva může být vysvětleno skutečností, že UC tlustého střeva obsahuje především cryptal epitelu.

AGREGÁTŮ VE STŘEVNÍ TKÁNI UC PACIENTŮ, TÉMĚŘ VÝLUČNĚ TVOŘÍ T A B LYMFOCYTŮ

Agregáty byly analyzovány na přítomnost tři hlavní typy lymfocytů: T-buněk (anti-CD3 mAb), B-buňky (směs anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22 mAbs), a NK buňky. Pro analýzu NK buňky, anti-CD57 mAb byl vybrán jak jsme již dříve ukázali, že αβ a γδ T buněk exprimujících klasické NK buněčných markerů CD56 jsou přítomny v lidském střevě.25 Anti-CD15 bylo použito k detekci granulocytů, anti-CD14 pro krevní monocyty / nedávno rekrutované makrofágy a anti-CD68 pro tkáňové makrofágy. K detekci folikulárních dendritických buněk (FDC) byly použity tři různé Mab (tabulka 2). Anti-CD80 / B7. 1 byl použit k detekci buněk s funkcí prezentace antigenu a anti-CD1a byl použit jako další marker pro dendritické / Langerhansovy buňky. Výsledky imunomorfometrické analýzy jsou shrnuty na obr. 3. Dva hlavní typy buněk jsou T a B buněk a součtu CD3+ buňky a CD19/20/22+buňky se rovnal počtu průkazu cd45+ buněk ve většině vzorků (77 (12)% ve srovnání s 74 (7)% průkazu cd45+ buněk (n=9)). T A B buňky představovaly stejně velké podíly buněk v agregátech. Agregáty obsahovaly velké oblasti T buněk bez B buněk a reciproční oblasti ovládané B buňkami s pouze několika rozptýlenými T buňkami (obr. 2A, B). Většina agregátů sestávala z hustě zabalených buněk, ale v některých případech byly v zóně B detekovány omezené oblasti volněji zabalených buněk. Podíl B buněk byla výrazně vyšší v agregáty těžce nemocných UC tlustého střeva ve srovnání s mírně nemocné tkáně (43 (8)v 30 (6); p=0,03), což naznačuje větší význam z B buněk v těžkých forem onemocnění. Osamělé folikuly v normálním tlustém střevě měly mírně odlišný vzhled. Střed folikulu obsahoval volně zabalené Velké B buňky s několika T buňkami, obklopené zónou B I T buněk a oblastmi na periferii, které obsahovaly pouze T buňky (obr. 2D, E).

folikulární dendritické buňky byly detekovány v sedmi z devíti vzorků UC za použití tří různých anti-FDC Mab. Mezi třemi Mab nebyl pozorován žádný rozdíl ve vzorcích barvení. Pozitivně obarvené folikulární dendritické buňky vytvořily síť, která byla umístěna v oblasti B buněk agregátů (obr. 2B, C). Ačkoli každý agregát obsahoval alespoň jednu oblast B buněk, pouze asi 40% obsahovalo síť FDC. Sítě FDC nebyly nikdy vidět v oblastech T buněk. V normálním tlustém střevě obsahoval každý folikul síť FDC, která byla omezena na oblast B buněk (obr. 2E, F). CD80/B7.1 + dendritické buňky byly také přítomny v agregátech UC tlustého střeva. Nejčastěji byly viděny jako jednotlivé dendritické buňky obklopené malými CD80 + tečkami mezi lymfocyty, pravděpodobně průřezy dendritických výčnělků. Občas byla vidět kompletní síť CD80+ buněk (obr. 1E). Tato síť byla umístěna v oblasti T buněk. V agregátech nebyly detekovány žádné CD1a + buňky s dendritickou morfologií.

ačkoli byl podíl granulocytů, buněk CD15+, ve většině vzorků UC zvýšený, byly tyto buňky obecně umístěny mimo agregáty (obr. 3). Četné tkáňové makrofágy, CD68 + buňky, byly přítomny v lamina propria mimo agregáty. V agregátech byly vzácné a nacházely se ve vnějším okraji (obr. 3). V normálním tlustém střevě byla většina buněk CD68+ lokalizována v blízkosti luminálního epitelu.29 agregátů s významným počtem buněk CD14+ bylo pozorováno pouze ve dvou vzorcích. Tyto vzorky měly také vysokou frekvenci CD14+buněk v submukóze (to je, ≈3.5% CD14+ buněk ve srovnání s ≈1% CD14+ buňky v jiných UC tlustého střeva vzorky a kontroly tlustého střeva). Kromě toho byly buňky CD14+ koncentrovány v blízkosti krevních cév, což naznačuje pokračující invazi monocytů. Neexistoval žádný zřejmý klinický parametr, který by mohl vysvětlit, proč došlo k invazi monocytů, zejména u těchto dvou vzorků. NK buňky, CD57 + buňky, byly vzácné jak v UC, tak v normální tkáni tlustého střeva a byly detekovány pouze příležitostně v agregátech (obr. 3).

lymfoidní agregáty v UC tlustého střeva se významně neliší od osamělé folikuly v normální tlustého střeva s ohledem na čísla z T buňky, B buňky, makrofágy/monocyty, granulocyty a NK buňky (obr 3). Kromě toho byla v obou typech struktur pozorována síť FDC umístěná v zóně B buněk. Nicméně, agregáty postrádal typické zárodečné centrum-jako B-buňky zóny s volně balené B buněk, která je vidět v normální osamělé folikuly. Kromě toho agregáty v UC colon zabíraly až 45% lamina propria.

AGREGÁTŮ V UC STŘEVĚ JSOU KOLONIZOVÁNA γδ T BUŇKY

překvapivě velké množství buněk v agregátech byly γδ T buněk (11 (7%) TcR γδ+ buněk (n=9)) (obr 1B,3). Naproti tomu ve folikulích normálního tlustého střeva nebyly detekovány téměř žádné γδ T buňky (0,3 (0.3)% TCR-γδ+ buněk (n=8) (p<0,001)) (obr. 3). Počet buněk TCR-γδ+ v agregátech se zvyšoval se závažností onemocnění. Poměr TcR-αβ+ buněk TcR γδ+ buněk v agregátech byl 2,4 (0.9) u těžce nemocných UC vzorků (n=6), ale pohybovala od 1,3 do 42 v mírně nemocné vzorky (n=3) a byl >300 v normální tlustého střeva folikuly. V pěti vzorcích byly stanoveny frekvence γδ T buněk jak v agregátech, tak v lamina propria mimo agregáty. V agregátech byla frekvence TCR-γδ+ buněk 3,9 (2 .5) krát vyšší než mimo agregáty. TCR-γδ+ buňky v agregátech převážně exprimovaly Vδ1, zatímco většina buněk používajících Vδ2 byla nalezena mimo agregáty. Celková LPL frakce byla analyzována pro použití genu Vδ pomocí imunoflow cytometrie na izolovaných buňkách. V dohodě s imunohistochemické výsledky, 86 (10)% z TcR γδ+buněk vyjádřil Vδ1 zatímco zbývající buňky vyjádřil Vδ2 (table4). V souladu s ultrastrukturální analýza γδ+ T buňky (viz níže), barvení TcR γδ+buňky často ukázal nerovnoměrný nebo skvrnitý vzhled na imunohistochemie (obr 1B, vložka) a zobrazí relativně nízká intenzita fluorescence v immunoflow cytometrie (obr 4). Vzhledem k heterogennímu vzoru barvení pro TcR-γδ může být počet γδ+ T buněk podhodnocen. Dvě barevné immunoflow cytometrie analýzy izolovaných LPL ukázal, že téměř všechny γδ+ T buněk vyjádřil CD45R0. Až 15% γδ+ T buněk vyjádřil CD8 ale většina γδ+ T buňky CD4/CD8 dvakrát negativní.

CD4+CD28−αβ T lymfocyty PŘEDSTAVUJÍ HLAVNÍ T BUNĚČNÉHO PODTYPU V AGREGÁTECH

většina z T buněk v agregáty vyjádřil TcR αβ a podílu CD4+ buněk byl vyšší než podíl CD8+ buněk (obr 3) s průměrnou CD4/CD8 poměr 1.7 (0.7) (n=8). Dominance CD4 + buněk byla ještě výraznější, když byly analyzovány izolované LPL (obr. 4). Dvě barevné immunoflow cytometrie analýzy LPL ukázal, že téměř všechny CD4+ buněk vyjádřil TcR αβ (údaje nejsou uvedeny). CD8 + buňky byly nalezeny pouze v oblasti T buněk agregátů, zatímco CD4 + buňky byly přítomny jak v oblasti T buněk, tak rozptýleny v oblasti B buněk. V několika vzorcích součet buněk CD4+ a CD8+ překročil počet buněk CD3+ a / nebo buněk TcR+. To pravděpodobně odráží podcenění T-buňky, protože z nízké úrovně exprese CD3/TcR komplexu, spíše než přítomnost CD4/CD8 dvojí pozitivní buňky jako pouze 2.4 (1.3)% (n=4) z celkového LPL byly dvojí pozitivní v immunoflow cytometrie analýzy (obr 4). I když četné buňky vyjadřující T-buněk co-receptor CD28 byly rozptýleny v lamina propria mimo agregáty (13 (2)% CD28+ buněk (n=3)) ne CD28+ buňky byly detekovány v souhrnných ukazatelů (tabulka 5; obr 1D).

nebyly žádné významné rozdíly v četnosti a fenotypy αβ T lymfocytů podskupin mezi agregáty v UC tlustého střeva a osamělý folikuly v řízení tlustého střeva (obr 3).

VĚTŠINA B BUNĚK V AGREGÁTY EXPRESS IgM NA JEJICH POVRCHU

většina buněk v B buněčné oblasti agregátů ukázaly, barvení anti-IgM mAb (42 (5)% IgM+ buněk (n=4)), což odpovídá 95 (7)% CD19/20/22+ buněk. Bylo však také zjištěno méně než 19 (2)% buněk v agregátech exprimovaných IgA a malá frakce IgG+ buněk (3,3 (0,4)% (n=4)). Tyto údaje naznačují, že B buňky v souhrnné ukazatele vyjádřit více než jednu izotypů imunoglobulinů a mohou se v poslední době prošly třídy přepínání. Žádné buňky Ig + nevykazovaly cytoplazmatické barvení, což naznačuje, že plazmatické buňky nebyly přítomny v agregátech. Naproti tomu plazmatické buňky byly nalezeny mimo agregáty.

IgM+ buněk (28 (2)% (n=4)) v přesile IgA+buněk (14 (1)% (n=4)) a IgG+ buněk (2.2 (o 0,4)% (n=4)) v folikulů kontrolu tlustého střeva. Součet ig + buněk se však rovnal počtu CD19/20/22+ buňky v jednotlivých vzorcích. Další zajímavé, i když nebyl žádný významný rozdíl v počtu B buněk ve folikulech ve srovnání s agregáty (obr 3), podíl povrchu IgM+buňky, povrch IgA+ buněk, a povrch IgG+buněk byla výrazně vyšší v agregáty UC tlustého střeva než v folikulů kontrolu tlustého střeva (p<0.01 pro všechny tři isotypes).

VÝRAZ PODTYPU NON-VYHRAZENÉ ZNAKY V LYMFOIDNÍ AGREGÁTY UC tlustého STŘEVA

Přibližně 50% buněk v lymfoidních agregátů vyjádřil paměť/aktivační marker CD45R0 (tabulka 5). Analýza izolovaných LPL navíc ukázala, že buňky exprimující CD45R0 a CD45RA tvoří přibližně 50% populace (n=4). Většina CD3 + buněk exprimovala CD45R0, ale byla také přítomna významná frakce CD45RA exprimujících CD3+ buněk (obr. 4). Většina buněk exprimujících CD45R0 byly T buňky a 20-40% buněk CD45R0 + byly B buňky. Ve dvou vzorcích na součet CD45R0 a CD45RA vyjádření buňky překročila 100%, což naznačuje, že buňky vyjadřující jak splice varianty mohou být přítomny současně.

většina buněk exprimujících MHC třídy II byla lokalizována v oblasti B buněk, ale rozptýlené pozitivní buňky MHC třídy II byly pozorovány v oblasti T buněk(údaje nejsou zobrazeny). Podíl buněk exprimujících HLA-DR byl přibližně 50% (tabulka 5). V pět vzorků počet HLA-DR+ buněk překročil počet B buněk, což naznačuje, že některé T-buněk v agregáty (31-89% CD3+buněk v těchto jednotlivých vzorků) také vyjádřit HLA-DR Podobné výsledky byly získány tři vzorky analyzovány pro HLA-DQ výraz (table5).

je zajímavé, že integrin aEß7, který je přítomen na velkém počtu IEL v normálním střevě, byl exprimován na 26 (13)% buněk v agregátech (obr. 1C, tabulka 5). Pozitivní buňky vykazovaly heterogenní distribuci, s některými oblastmi s mnoha pozitivními buňkami a dalšími oblastmi s několika pozitivními buňkami. Buňky vyjadřující aeexpresi vykazovaly rozdíly v intenzitě barvení (obr. 1C).

jedna třetina lymfocytů v agregátech exprimovala antiapoptotický protein bcl-2(obr. 1F, tabulka 5). Buňky exprimující Bcl-2 byly rozptýleny po celém agregátu. V normálních solitárních folikulech bylo pozorováno asi 10% Bcl-2 pozitivních buněk. Všechny byly umístěny v zóně B buněk.

ULTRASTRUKTURÁLNÍ ANALÝZA γδ T BUNĚK V UC tlustého STŘEVA UKAZUJÍ, INTERNALIZACE A POVRCH DOWNREGULATION OF TcR γδ

immunoelectron mikroskopie šetření byla zaměřena na γδ T buněk v UC tlustého střeva. Pro srovnávací účely jsme také analyzovali γδ T buňky v normální sliznici tlustého střeva. TcR-γδ byl detekován jako depozity reakčního produktu hustého elektronem.

V normální tlustého střeva, reakční produkt byl homogenně distribuován na povrchu buněk všech γδ T buňky, a to jak na ty, které se nachází v lamina propria (obr. 5A) a na intraepiteliální γδ T buněk (obr 5B).

naproti tomu γδ T buňky v UC tlustém střevě vykazovaly extrémní variabilitu distribuce reakčního produktu z povrchu buňky do cytoplazmy. Identifikovali jsme pět typů vzorů barvení (pět morfotypů). γδ T buňky prvního typu (obr. 6A) vykazovaly heterogenní distribuci reakčního produktu na povrchu buňky. Některé vykazovaly jednotlivé pozitivně obarvené multivesikulární těla. V γδ T buňkách druhého typu byl reakční produkt vnímán jako vzácné lineární shluky více či méně náhodně rozložené po povrchu buňky (obr. 6B). Kromě toho, některé clustery vklady byly lokalizovány nad a v rámci povrch invaginací, které se lišily od mělké jámy hlubší baňky ve tvaru invaginací (obr 6B, vložka). Nebylo možné použít další protibarvení. Ačkoli tedy některé povrchové invaginace připomínaly potažené jámy, nemohli jsme určit, zda byly tyto invaginace potaženy. V γδ T buňkách třetího typu byl reakční produkt umístěn jako shluky buněčného povrchu a také v cytoplazmatických vakuolách s morfologickými charakteristikami endosomů (obr. 6C). V γδ T buňkách čtvrtého typu byl reakční produkt hojně přítomen v cytoplazmě, ale sotva detekovatelný na povrchu buňky (obr. 6D, E, F). Reakční produkt barevné četné cytoplazmatické váčky a vakuoly v blízkosti buněčné membrány a také hluboko v buňkách blízko jádra. Pozitivně obarvené vezikuly byly někdy pozorovány v kontinuitě s plazmatickou membránou a připomínaly potažené vezikuly (obr. 6E). Byly také obarveny četné multivesikulární těla sestávající z těsně zabalených mikrovesicles (obr. γδ T buňky pátého typu byly vzácné (obr. 6G, H). Tento morfotyp obvykle vykazoval silné pozitivní zbarvení plazmatické membrány a perinukleárního prostoru. Někdy reakční produkt obarvené různé cytoplazmatické vakuoly různých velikostí a tvarů. Nebyl pozorován žádný zřejmý rozdíl mezi jednotlivými studovanými vzorky tlustého střeva UC.

stručně řečeno, většina γδ T buněk (morfotypů 1-4) v UC tlustého střeva vystavoval buněčné lokalizaci reakční produkt s největší pravděpodobností odrážejí různé po sobě jdoucí kroky TcR internalizace: formování klastrů, potažené jámy, křídový puchýřky, endosomes, a multivesicular těla.30 malý počet buněk (morfotyp 5) vykazoval aktivní syntézu molekul TCR-γδ.