Karakterisering af mucosale lymfoide aggregater i ulcerøs colitis: immuncellefænotype og TCR-kur-ekspression | gut

resultater

leukocytter udgør den største celletype i betændt UC-kolon og distribueres forskelligt i TYKTARMSLIMHINDEN hos UC-patienter sammenlignet med kontroller

tolv prøver af betændt sigmoid-kolon fra UC-patienter og 15 prøver af tilsyneladende normal sigmoid-kolon fra patienter uden historie med IBD blev underkastet fænotypisk analyse ved hjælp af immunhistokemi. Ni af disse UC-prøver blev klassificeret som alvorligt syge. I disse blev epitelet fladt med reduceret antal bægerceller, forgrenede krypter og lejlighedsvis ulcerationer. Crypt abscesser var almindelige. Lamina propria indeholdt adskillige spredte leukocytter såvel som basale lymfoide aggregater (fig 1A). Tre UC-prøver blev klassificeret som moderat syge. I alt var epitelet intakt med let reduceret antal bægerceller og ingen/få forgrenede Krypter. Lamina propria indeholdt et øget antal leukocytter, og lymfoide aggregater var til stede. Den morfometriske analyse var fokuseret på aggregaterne.

aggregaterne omfattede nodulære fusionerende klynger af lymfocytter uden typiske reaktive Centre. De var placeret mellem baserne af krypterne og submucosa uden tilsyneladende kontakt med luminalepitelet (fig 1A). Imidlertid blev nærhed mellem celler i aggregaterne og kryptepitelet ofte bemærket (fig 1A, D). Hyppigheden af aggregater (antal/areal) var ens i moderat og alvorligt sygt væv, der varierede fra 1,3 til 4,9 aggregater pr.mm2 lamina propria (tabel 3). Imidlertid steg arealet af lamina propria besat af aggregaterne med sværhedsgraden af sygdommen og udgjorde så meget som 45% af lamina propria i alvorligt syg kolon fra nogle patienter (tabel 3). Normale ensomme follikler i kontrol kolon var sjældne (mindre end 0,1 follikel/mm2 af lamina propria, n=8).

cirka 75% af cellerne i aggregaterne var leukocytter (74 (7)% CD45+ celler (n = 9)). Andelen af leukocytter i ensomme lymfoide follikler var også høj (67 (6)% CD45+celler (n=8)). Begge værdier kan undervurderes, da farvning med anti-CD45 mAb var heterogen. Denne heterogene farvning kan forklares, i det mindste delvist, ved nedsat ekspression af CD45 på aktiverede B-celler.

antallet af leukocytter både i lamina propria uden for aggregaterne (26 (7)% CD45+ celler (n=4)) og i submucosa (8 (2)% CD45+ celler (n=4)) blev øget i UC-kolon sammenlignet med normal kolon (15 (2)% CD45+ celler i lamina propria uden for folliklerne og 4 (2)% CD45+celler i submucosa (n=4)).

Intraepiteliale leukocytter var til stede i lavere frekvenser i UC-kolon sammenlignet med normal kolon: 28 (7) CD45+ celler/1000 epitelceller i alvorligt sygt kolonvæv (n=4) sammenlignet med 66 (26) CD45+ celler/1000 epitelceller i kontroller (n=4, p=0,03). IEL blev hovedsageligt påvist i kryptalepitelet i UC-kolon, delvis på grund af erosioner af luminal overfladeepitel. I normal kolon var > 60% af IEL placeret i luminalepitelet. Da tætheden af IEL således er lavere i kryptal end i luminalepitel i normal kolon, kan den lavere frekvens af iel i UC-kolon forklares med det faktum, at UC-kolon hovedsageligt indeholder kryptalepitel.

aggregater i TYKTARMSVÆVET hos UC-patienter omfatter næsten udelukkende T-og B-lymfocytter

aggregater blev analyseret for tilstedeværelsen af de tre hovedtyper af lymfocytter: T-celler (anti-CD3 mAb), B-celler (en blanding af anti-CD19, anti-CD20 og anti-CD22 MAB ‘ er) og NK-celler. Til analyse af NK-celler, anti-CD57 mAb blev valgt, da vi tidligere har vist, at der i den menneskelige tarm er til stede i den klassiske NK-CELLEMARKØR cd56.25 Anti-CD15 blev brugt til at detektere granulocytter, anti-CD14 for blodmonocytter/for nylig rekrutterede makrofager og anti-CD68 til vævsmakrofager. Til påvisning af follikulære dendritiske celler (FDC) blev der anvendt tre forskellige MAB ‘ er (tabel 2). Anti-CD80/B7.1 blev anvendt til at detektere celler med antigenpræsenterende funktion, og anti-CD1a blev anvendt som en yderligere markør for dendritiske / Langerhans celler. Resultaterne af den immunomorfometriske analyse er opsummeret i figur 3. De to vigtigste celletyper var T-og B-celler og summen af CD3 + – celler og CD19/20/22+celler svarede til antallet af CD45 + celler i de fleste prøver (77 (12)% sammenlignet med 74 (7)% CD45+ celler (n=9)). T-og B-celler udgjorde lige store andele af cellerne i aggregaterne. Aggregaterne indeholdt store t-celleområder uden B-celler og gensidige områder domineret af B-celler med kun få spredte T-celler (fig 2A, B). De fleste aggregater bestod af tætpakkede celler, men i nogle tilfælde blev der påvist begrænsede områder af mere løst pakkede celler i B-celleområdet. Andelen af B-celler var signifikant højere i aggregater af alvorligt sygt UC-kolon sammenlignet med moderat sygt væv (43 (8)v 30 (6); p=0,03), hvilket antyder øget betydning af B-celler i svære sygdomsformer. Solitære follikler i normal kolon havde et lidt anderledes udseende. Follikelens centrum indeholdt løst pakkede Store b-celler med få, hvis nogen, T-celler, omgivet af et område med både B-og T-celler og områder i periferien, der kun indeholdt T-celler (fig 2D, E).

follikulære dendritiske celler blev påvist i syv ud af ni UC-prøver ved anvendelse af tre forskellige anti-FDC MAB ‘ er. Der blev ikke set nogen forskel i farvningsmønstre mellem de tre MAB ‘ er. De positivt farvede follikulære dendritiske celler dannede et netværk, der var placeret i Aggregaternes B-celleområde (fig 2B, C). Selvom hvert aggregat indeholdt mindst et B-celleområde, indeholdt kun omkring 40% et FDC-netværk. FDC-netværk blev aldrig set i T-celleområder. I normal kolon indeholdt hver follikel et FDC-netværk, der var begrænset til B-celleområdet (fig 2E, F). CD80 / B7.1 + dendritiske celler var også til stede i aggregaterne af UC-kolon. De blev oftest set som enkelt dendritiske celler omgivet af små CD80+ prikker mellem lymfocytter, formodentlig tværsnit af dendritiske fremspring. Lejlighedsvis kunne et komplet netværk af CD80 + celler ses (fig 1E). Dette netværk var placeret i et T-celleområde. Ingen CD1a + celler med en dendritisk morfologi blev påvist i aggregaterne.

skønt andelen af granulocytter, CD15+ celler, var forhøjet i de fleste UC-prøver, var sådanne celler generelt placeret uden for aggregaterne (fig 3). Talrige vævsmakrofager, CD68 + celler, var til stede i lamina propria uden for aggregaterne. I aggregaterne var de knappe og placeret i den ydre kant (fig 3). I normal kolon blev de fleste CD68+ celler lokaliseret i nærheden af luminalepitelet.29 aggregater med et betydeligt antal CD14+ celler blev kun set i to prøver. Disse prøver havde også en høj frekvens af CD14+celler i submucosa (det vil sige 3,5% CD14+ celler sammenlignet med 1% CD14+ celler i andre UC-kolonprøver og kontrolkolon). Desuden blev CD14+ celler koncentreret nær blodkar, hvilket tyder på løbende invasion af monocytter. Der var ingen åbenlys klinisk parameter, der kunne forklare, hvorfor monocytinvasion havde fundet sted, især i disse to prøver. NK-celler, CD57 + – celler, var sjældne både i UC og normalt tyktarmsvæv og blev kun lejlighedsvis påvist i aggregater (fig3).

lymfoide aggregater i UC-kolon adskiller sig ikke signifikant fra ensomme follikler i normal kolon med hensyn til antallet af T-celler, B-celler, makrofager/monocytter, granulocytter og NK-celler (fig 3). Desuden blev der set et FDC-netværk placeret i B-celleområdet i begge typer strukturer. Aggregaterne manglede imidlertid et typisk germinalt centerlignende B-celleområde med løst pakkede B-celler, som ses i normale ensomme follikler. Desuden optog aggregaterne i UC-kolon op til 45% af lamina propria.

aggregater i UC-kolon koloniseres af DI-T-celler

et overraskende stort antal af cellerne i aggregaterne var di-T-celler (11 (7%) TCR-di-r+ – celler (n=9)) (fig.1b,3). I modsætning hertil blev der næsten ikke påvist nogen correct T-celler i follikler af normal kolon (0,3 (0.3)% TcR-LARP+ celler (n=8) (p<0,001)) (fig 3). Antallet af TCR-kurr+ celler i aggregaterne steg med sværhedsgraden af sygdommen. Forholdet mellem TCR-Kurt+ – celler og TCR-Kurt + – celler i aggregaterne var 2,4 (0,9) i alvorligt syge UC-prøver (N=6), men varierede fra 1,3 til 42 i moderat syge prøver (N=3) og var >300 i normale kolon follikler. I fem prøver blev frekvenserne af Chast T-celler både i aggregater og i lamina propria uden for aggregaterne bestemt. I aggregaterne var frekvensen af TCR-Kurt+ celler 3,9 (2.5) gange højere end uden for aggregaterne. TCR-kurr+ – celler i aggregaterne udtrykte hovedsageligt V-Kurr1, mens de fleste celler, der anvendte V-Kurr2, blev fundet uden for aggregaterne. Den samlede LPL-fraktion blev analyseret for anvendelse af V-Larose-gen ved immunflydende cytometri på isolerede celler. I overensstemmelse med de immunhistokemiske resultater udtrykte 86 (10)% af TCR-lyrus+ – cellerne V-Lyrus1, mens de resterende celler udtrykte V-Lyrus2 (tabel4). I tråd med den ultrastrukturelle analyse af Kurt+ T-celler (se nedenfor) viste farvning af TCR-Kurt+ – celler ofte et plettet eller plettet udseende på immunhistokemi (fig 1b, indsat) og viste en relativt lav fluorescensintensitet i immunflydende cytometri (fig 4). På grund af det heterogene farvningsmønster for TcR-kursist kan antallet af korpst+ T-celler være en undervurdering. To farveimmunflydende cytometrianalyse af isoleret LPL viste, at næsten alle LARP+ T-celler udtrykte cd45r0. Op til 15% af de CRP+ T-celler udtrykte CD8, men de fleste CRP+ T-celler var CD4/CD8 DOBBELTNEGATIVE.

CD4 + CD28-klare T-celler udgør hoved-T-CELLEUNDERTYPEN i aggregaterne

størstedelen af T-celler i aggregaterne udtrykt TCR-kur, og andelen af CD4+ – celler var højere end andelen af CD8+ – celler (fig.3) med et gennemsnitligt CD4/CD8-forhold på 1,7 (0.7) (n=8). Dominansen af CD4 + – celler var endnu mere udtalt, når isoleret LPL blev analyseret (fig 4). To farveimmunflydende cytometrianalyse af LPL viste, at næsten alle CD4+ celler udtrykte TcR-Karr (data ikke vist). CD8 + – celler blev kun fundet i Aggregaternes t-celleområde, mens CD4+ – celler var til stede både i T-celleområdet og spredt i B-celleområdet. I flere prøver oversteg summen af CD4+ – og CD8 + – celler antallet af CD3 + – celler og / eller TCR+ – celler. Dette afspejler sandsynligvis undervurdering af T-celler på grund af det lave niveau ekspression af CD3/TcR-komplekset snarere end tilstedeværelsen af CD4/CD8 dobbelt positive celler, da kun 2,4 (1,3)% (n=4) af den samlede LPL var dobbelt positive i immunflydende cytometrianalyse (fig 4). Selvom talrige celler, der udtrykker t-cellens co-receptor CD28, blev spredt i lamina propria uden for aggregaterne (13 (2)% CD28+ celler (n=3)), blev der ikke påvist CD28+ celler i aggregaterne (tabel 5; fig 1D).

der var ingen signifikante forskelle i frekvenserne og fænotyperne af undergrupper af celler i celler i den UC-kolon mellem aggregater i UC-kolon og ensomme follikler i kontrolkolonmen (fig.3).

de fleste B-celler i aggregaterne udtrykker IgM på deres overflade

flertallet af celler i B-celleområdet af aggregater viste farvning med anti-IgM mAb (42 (5)% IgM+ celler (n=4)) svarende til 95 (7)% af CD19-cellens/20/22+ celler. Imidlertid blev ikke mindre end 19 (2)% af cellerne i aggregaterne udtrykt IgA og en lille brøkdel af IgG+ – celler (3,3 (0,4)% (n=4)) også påvist. Disse data antyder, at B-celler i aggregaterne udtrykker mere end en immunoglobulinisotype og for nylig kan have gennemgået klasseskift. Ingen ig+ – celler viste cytoplasmatisk farvning, hvilket indikerer, at plasmaceller ikke var til stede i aggregaterne. I modsætning hertil blev plasmaceller fundet uden for aggregaterne.

IgM+ celler (28 (2)% (n=4)) overgik IgA+celler (14 (1)% (n=4)) og IgG+ celler (2, 2 (0, 4)% (n=4)) i folliklerne i kontrol kolon. Summen af IG + – celler svarede imidlertid til antallet af CD19/20/22+ celler i individuelle prøver. Mere interessant, selv om der ikke var nogen signifikant forskel i antallet af B-celler i follikler sammenlignet med aggregater (fig 3), var andelen af overflade IgM+celler, overflade IgA+ celler og overflade IgG+celler signifikant højere i aggregater af UC kolon end i follikler af kontrol kolon (p<0,01 for alle tre isotyper).

ekspression af subtype ikke-begrænsede markører i lymfoide aggregater af UC-kolon

cirka 50% af cellerne i lymfoide aggregater udtrykte hukommelse/aktiveringsmarkøren CD45R0 (tabel 5). Desuden viste analyse af isoleret LPL, at CD45R0-og CD45RA-ekspressionsceller hver udgjorde ca.50% af populationen (n=4). Størstedelen af CD3 + – celler udtrykte CD45R0, men en signifikant brøkdel af CD45RA, der udtrykte CD3+ – celler, var også til stede (fig 4). Størstedelen af cd45r0-udtrykkende celler var T-celler, og 20-40% af CD45R0+ – cellerne var B-celler. I to prøver oversteg summen af cd45r0-og CD45RA-ekspressionsceller 100%, hvilket tyder på, at celler, der udtrykker begge splejsningsvarianter, kan være til stede samtidigt.

størstedelen af MHC-klasse II-ekspressionsceller var placeret i B-celleområdet, men spredte MHC-klasse II-positive celler blev set i T-celleområdet (data ikke vist). Andelen af celler, der udtrykker HLA-DR, var ca.50% (tabel 5). I fem prøver oversteg antallet af HLA-DR+ – celler antallet af B-celler, hvilket indikerer, at nogle T-celler i aggregaterne (31-89% af CD3+ – cellerne i disse individuelle prøver) også udtrykker HLA-DR. lignende resultater blev opnået med tre prøver analyseret for HLA-DKV-ekspression (tabel 5).

interessant nok blev integrin ae-kur7, som er til stede på et stort antal IEL i normal tarm, udtrykt på 26 (13)% af cellerne i aggregaterne (fig 1C, tabel 5). Positive celler viste en heterogen fordeling med nogle områder med mange positive celler og andre områder med få positive celler. De aeekspressive celler viste variation i intensiteten af farvning (fig1C).

en tredjedel af lymfocytter i aggregaterne udtrykte det antiapoptotiske protein bcl-2 (fig 1F, tabel 5). Bcl – 2-ekspressionsceller blev spredt over hele aggregatet. I normale ensomme follikler blev omkring 10% af bcl-2-positive celler set. De var alle placeret i B-celleområdet.

ULTRASTRUKTUREL analyse af urin T-celler i UC-kolon viser internalisering og nedregulering af overfladen af TCR-urin

undersøgelsen af immunoelektronmikroskopi var fokuseret på urin T-celler i UC-kolon. Til komparative formål analyserede vi også T-celler i normal kolonslimhinde. TcR-Kerr blev detekteret som aflejringer af det elektrontætte reaktionsprodukt.

i normal kolon blev reaktionsproduktet homogent fordelt på celleoverfladen af alle fundne CRT-celler, både på dem, der er placeret i lamina propria (fig 5A) og på de intraepiteliale CRT-celler (fig 5B).

i modsætning hertil udviste kur T-celler i UC-kolon ekstrem variation i fordelingen af reaktionsproduktet fra celleoverflade til cytoplasma. Vi identificerede fem typer farvningsmønstre (fem morfotyper). 6A) viste en heterogen fordeling af reaktionsproduktet på celleoverfladen. Nogle udstillede enkelt positivt farvede multivesikulære kroppe. I den anden type af den anden type blev reaktionsproduktet set som knappe lineære klynger mere eller mindre tilfældigt fordelt over celleoverfladen (fig.6b). Derudover blev nogle klyngede aflejringer lokaliseret over og inden for overfladeinvaginationer, der varierede fra lavvandede gruber til dybere kolbeformede invaginationer (fig 6b, indsat). Det var ikke muligt at anvende yderligere modfarvning. Selv om nogle af overfladeinvaginationerne lignede belagte gruber, kunne vi således ikke afgøre, om disse invaginationer var belagt eller ej. I celler af den tredje type var reaktionsproduktet placeret som celleoverfladeklynger og også i cytoplasmatiske vakuoler med morfologiske egenskaber ved endosomer (fig 6C). I celler af den fjerde type var reaktionsproduktet rigeligt til stede i cytoplasmaet, men næppe detekterbart på celleoverfladen (fig 6D, E, F). Reaktionsproduktet farvede adskillige cytoplasmatiske vesikler og vakuoler nær cellemembranen og også dybt i cellerne tæt på kernen. Positivt farvede vesikler blev undertiden set i kontinuitet med plasmamembranen og lignede overtrukne vesikler (fig 6E). Talrige multivesikulære legemer bestående af tætpakkede mikrovesikler blev også farvet (fig 6F). T-celler af den femte type var sjældne (fig 6g, h). Denne morfotype viste normalt stærk positiv farvning af plasmamembranen og det perinukleære rum. Nogle gange farves reaktionsproduktet forskellige cytoplasmatiske vakuoler i forskellige størrelser og former. Der blev ikke set nogen åbenbar forskel mellem de enkelte undersøgte UC-kolonprøver.

kort sagt udviste størstedelen af de korptiske T-celler (morfotyper 1-4) i UC-kolon cellulær lokalisering af reaktionsproduktet, hvilket sandsynligvis afspejlede de forskellige på hinanden følgende trin i TcR-internalisering: dannelse af klynger, coatede gruber, coatede vesikler, endosomer og multivesikulære legemer.30 et lille antal celler (morphotype 5) viste aktiv syntese af TcR-Kurt molekyler.