Charakterystyka śluzówkowych agregatów limfoidalnych we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego: fenotyp komórek immunologicznych i ekspresja TCR-γδ | Gut

wyniki

leukocyty stanowią główny typ komórek w zapalnym okrężnicy i rozprowadzają się w inny sposób w błonie śluzowej okrężnicy u pacjentów z przewlekłym zapaleniem jelita grubego w porównaniu z grupą kontrolną

dwanaście próbek zapalnego esicy od pacjentów z przewlekłym zapaleniem jelita grubego i 15 próbek pozornie prawidłowych esicy od pacjentów bez wywiadu.IBD poddano analizie fenotypowej metodą immunohistochemii. Dziewięć z tych próbek UC zostało sklasyfikowanych jako ciężko chore. U nich nabłonek był spłaszczony ze zmniejszoną liczbą komórek kielicha, rozgałęzionych krypt i sporadycznie owrzodzeń. Ropnie krypty były powszechne. Lamina propria zawierała liczne rozproszone leukocyty, a także podstawowe Agregaty limfoidalne (fig. Trzy okazy UC zostały sklasyfikowane jako średnio chore. W całym nabłonku zachowały się nieco zredukowane liczby komórek kielicha i brak / mało rozgałęzionych krypt. Lamina propria zawierała zwiększoną liczbę leukocytów i obecne były Agregaty limfoidalne. Analiza morfometryczna skupiła się na agregatach.

Agregaty składały się z guzkowo łączących się klastrów limfocytów bez typowych ośrodków reaktywnych. Znajdowały się one między podstawami krypt i podśluzów bez widocznego kontaktu z nabłonkiem luminalnym (fig. Często obserwowano jednak bliskość między komórkami w agregatach a nabłonkiem krypty (fig. 1A, D). Częstość występowania agregatów (liczba/powierzchnia) była podobna w umiarkowanie i ciężko chorych tkankach, w zakresie od 1,3 do 4,9 agregatów na mm2 blaszki proprii(tabela 3). Jednak obszar lamina propria zajmowany przez Agregaty zwiększał się wraz z nasileniem choroby i stanowił aż 45% lamina propria w ciężko chorym okrężnicy u niektórych pacjentów (tabela 3). Prawidłowe pojedyncze pęcherzyki w kontrolnym okrężnicy występowały rzadko(mniej niż 0,1 pęcherzyka/mm2 blaszki proprii, n = 8).

około 75% komórek w agregatach stanowiły leukocyty (74 (7) % komórek CD45+ (N = 9)). Udział leukocytów w samotnych pęcherzykach limfatycznych był również wysoki (67 (6) % komórek CD45+(N=8)). Obie wartości mogą być niedoszacowane, ponieważ barwienie anty-CD45 mAb było niejednorodne. To heterogeniczne zabarwienie można wyjaśnić, przynajmniej częściowo, zmniejszoną ekspresją CD45 na aktywowanych limfocytach B.

liczba leukocytów zarówno w blaszce propria poza agregatami (26 (7)% komórek CD45+ (n=4)), jak i w podśluzówce (8 (2)% komórek CD45+ (n=4)) była zwiększona w jelicie grubym w porównaniu z normalnym jelito grubym (15 (2)% komórek CD45+ w blaszce propria poza pęcherzykami i 4 (2)% komórek CD45+w podśluzówce (n=4)).

Wewnątrznabłonkowe leukocyty występowały z niższą częstością w okrężnicy UC w porównaniu z prawidłowym: 28 (7) komórek CD45+/1000 komórek nabłonkowych w ciężko chorej tkance jelita grubego (n=4) w porównaniu z 66 (26) komórek CD45+/1000 komórek nabłonkowych w grupach kontrolnych (n=4, p=0,03). IEL wykrywano głównie w obrębie nabłonka kryptalnego w okrężnicy UC, częściowo z powodu nadżerek nabłonka powierzchni luminalnej. W normalnym okrężnicy >60% IEL znajdowało się w nabłonku luminalnym. W związku z tym, że gęstość IEL jest mniejsza w nabłonku kryptalnym niż w nabłonku luminalnym w normalnym okrężnicy, mniejszą częstość występowania IEL w okrężnicy podskórnej można wytłumaczyć faktem, że okrężnica podskórna zawiera głównie nabłonek kryptalny.

Agregaty w tkance jelita grubego pacjentów z UC prawie wyłącznie zawierają limfocyty T i B

Agregaty analizowano pod kątem obecności trzech głównych typów limfocytów: limfocytów T (anty-CD3 mAb), limfocytów B (mieszanina anty-CD19, anty-CD20 i anty-CD22 MAB) i komórek NK. Do analizy komórek NK wybrano anty-CD57 mAb, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że komórki T αβ I γδ wyrażające klasyczny marker komórkowy NK CD56 są obecne w jelitach człowieka.25 anty-CD15 zastosowano do wykrywania granulocytów, anty-CD14 dla monocytów krwi / niedawno zrekrutowanych makrofagów i anty-CD68 dla makrofagów tkankowych. W celu wykrycia pęcherzykowych komórek dendrytycznych (FDC) zastosowano trzy różne MAB (tabela 2). Anty-CD80 / B7.1 zastosowano do wykrywania komórek z funkcją prezentującą antygen, a ANTY-CD1a jako dodatkowy marker dla komórek dendrytycznych/Langerhansa. Wyniki analizy immunomorfometrycznej podsumowano na fig. Dwa główne typy komórek to komórki T I B oraz suma komórek CD3+ i CD19/20/22+komórki odpowiadały liczbie komórek CD45+ w większości próbek (77 (12)% w porównaniu z 74 (7)% komórek CD45+ (n=9)). Komórki T i B stanowiły równie duże proporcje komórek w agregatach. Agregaty zawierały duże obszary komórek T bez komórek B i obszary wzajemne zdominowane przez komórki B z tylko kilkoma rozproszonymi komórkami T (fig. Większość agregatów składała się z gęsto upakowanych komórek, ale w niektórych przypadkach w strefie limfocytów B wykryto ograniczone obszary luźniej upakowanych komórek. Odsetek limfocytów B był znamiennie wyższy w agregatach ciężko chorego jelita grubego w porównaniu z umiarkowanie chorą tkanką (43 (8) v 30 (6); p=0,03), co sugeruje zwiększone znaczenie limfocytów B w ciężkich postaciach choroby. Pojedyncze pęcherzyki w normalnym okrężnicy miały nieco inny wygląd. Środek pęcherzyka zawierał luźno upakowane Duże limfocyty B z niewielką ilością limfocytów T, otoczone strefą zarówno limfocytów B, jak i limfocytów T, oraz obszary na obwodzie, które zawierały tylko limfocyty T (fig.2D, E).

pęcherzykowe komórki dendrytyczne wykryto w siedmiu z dziewięciu próbek UC przy użyciu trzech różnych MAB anty-FDC. Nie zaobserwowano różnic w barwieniu pomiędzy trzema MAB. Dodatnio zabarwione pęcherzykowe komórki dendrytyczne utworzyły sieć, która znajdowała się w obszarze komórki B agregatów (fig. Chociaż każdy agregat zawierał co najmniej jeden obszar komórki B, tylko około 40% zawierało sieć FDC. Sieci FDC nigdy nie były widoczne na obszarach komórek T. W normalnym okrężnicy każdy pęcherzyk zawierał sieć FDC, która była ograniczona do obszaru komórki B (fig. CD80/B7.1 + komórki dendrytyczne były również obecne w agregatach jelita grubego UC. Najczęściej postrzegano je jako pojedyncze komórki dendrytyczne otoczone małymi kropkami CD80+ między limfocytami, przypuszczalnie przekrojami wypukłości dendrytycznych. Czasami można było zobaczyć pełną sieć komórek CD80+ (ryc. 1E). Sieć ta znajdowała się w obszarze komórek T. W agregatach nie wykryto komórek CD1a+ o morfologii dendrytycznej.

chociaż odsetek granulocytów, komórek CD15+, był podwyższony w większości próbek UC, takie komórki były na ogół zlokalizowane poza agregatami (ryc. 3). Liczne makrofagi tkankowe, komórki CD68+, były obecne w blaszce proprii poza agregatami. W skupiskach były one rzadkie i zlokalizowane w zewnętrznej krawędzi (ryc. 3). W normalnym okrężnicy większość komórek CD68+ była zlokalizowana w pobliżu nabłonka luminalnego.W zaledwie dwóch próbkach stwierdzono 29 agregatów o znaczącej liczbie komórek CD14+. Próbki te miały również wysoką częstość występowania komórek CD14+w podśluzówce (tj. ≈3,5% komórek CD14+ w porównaniu z ≈1% komórek CD14+ w innych próbkach jelita grubego UC i okrężnicy kontrolnej). Ponadto, komórki CD14 + koncentrowały się w pobliżu naczyń krwionośnych, co sugeruje trwającą inwazję monocytów. Nie było oczywistych parametrów klinicznych, które mogłyby wyjaśnić, dlaczego doszło do inwazji monocytów, szczególnie w tych dwóch próbkach. Komórki NK, komórki CD57+, występowały rzadko zarówno w tkance jelita grubego, jak i w prawidłowej tkance jelita grubego i były jedynie sporadycznie wykrywane w agregatach (fig 3).

Agregaty limfoidalne w jelicie grubym nie różniły się znacząco od pojedynczych pęcherzyków w jelicie grubym pod względem liczby komórek T, komórek B, makrofagów/monocytów, granulocytów i komórek NK (ryc. 3). Ponadto w obu typach struktur zaobserwowano sieć FDC zlokalizowaną w strefie limfocytów B. Jednak Agregaty brakowało typowego centrum germinal jak B strefy komórek z luźno upakowanych komórek B, które jest widoczne w normalnych samotnych pęcherzyków. Ponadto Agregaty w okrężnicy UC zajmowały do 45% lamina propria.

Agregaty w okrężnicy UC są kolonizowane przez limfocyty tγδ

zaskakująco dużą liczbą komórek w agregatach były limfocyty tγδ (11 (7%) komórek TCR-γδ+ (N=9)) (fig. W przeciwieństwie do tego, prawie nie wykryto limfocytów tγδ w pęcherzykach prawidłowych jelita grubego (0,3 (0.3) % komórek TCR-γδ+ (N=8) (p<0,001)) (ryc. 3). Liczba komórek TCR-γδ + w agregatach wzrastała wraz z nasileniem choroby. Stosunek komórek TCR-αβ+ do komórek TCR-γδ + w agregatach wynosił 2,4 (0,9) w ciężko chorych próbkach UC (N=6), ale wahał się od 1,3 do 42 w umiarkowanie chorych próbkach (N=3) i wynosił >300 W normalnych pęcherzykach okrężnicy. W pięciu próbkach oznaczono częstotliwości limfocytów tγδ zarówno w agregatach, jak i w lamina propria poza agregatami. W agregatach częstość występowania komórek TCR-γδ+ wynosiła 3,9 (2 .5) razy wyższe niż poza agregatami. Komórki TCR-γδ+ w agregatach ulegały ekspresji głównie Vδ1, podczas gdy większość komórek wykorzystujących Vδ2 stwierdzono poza agregatami. Całkowitą frakcję LPL analizowano pod kątem wykorzystania genu Vδ za pomocą cytometrii immunoflow na izolowanych komórkach. Zgodnie z wynikami immunohistochemicznymi, 86 (10)% komórek TCR-γδ+wyrażało Vδ1, podczas gdy pozostałe komórki wyrażały vδ2 (Tabela 4). Zgodnie z analizą ultrastrukturalną limfocytów tγδ+ (patrz poniżej), barwienie komórek TCR-γδ + często wykazywało niejednolity lub plamisty wygląd na immunohistochemii (fig. 1B, wstawka) i wykazywało stosunkowo niską intensywność fluorescencji w cytometrii immunoflow (fig. 4). Ze względu na niejednorodny wzór barwienia dla TCR-γδ, liczba limfocytów tγδ + może być zaniżona. Dwubarwna analiza immunoflow cytometrii wyizolowanego LPL wykazała, że prawie wszystkie limfocyty γδ+ T ulegały ekspresji CD45R0. Do 15% limfocytów tγδ + ulegało ekspresji CD8, ale większość limfocytów tγδ + miała CD4 / CD8 podwójnie ujemny.

komórki T CD4 + CD28-αβ stanowią główny Podtyp komórek T w agregatach

większość komórek T w agregatach wyrażona TCR-αβ, a odsetek komórek CD4+ był wyższy niż odsetek komórek CD8+ (fig.7) (n=8). Dominacja komórek CD4+ była jeszcze bardziej wyraźna po analizie wyizolowanego LPL (ryc. 4). Dwukolorowa analiza immunoflow cytometrii LPL wykazała, że prawie wszystkie komórki CD4+ ulegały ekspresji TcR-αβ (dane nie pokazane). Komórki CD8+ znaleziono tylko w obszarze limfocytów T agregatów, podczas gdy komórki CD4+ były obecne zarówno w obszarze limfocytów T, jak i rozproszone w obszarze limfocytów B. W kilku próbkach suma komórek CD4+ i CD8+ przekroczyła liczbę komórek CD3+ i / lub komórek TcR+. Prawdopodobnie odzwierciedla to niedoszacowanie komórek T z powodu niskiego poziomu ekspresji kompleksu CD3/TCR, a nie obecności podwójnie dodatnich komórek CD4 / CD8, ponieważ tylko 2,4 (1,3)% (N=4) całkowitego LPL było podwójnie dodatnich w analizie cytometrii immunoflow (ryc. 4). Chociaż liczne komórki wykazujące ekspresję receptora CD28 dla komórek T były rozproszone w blaszce proprii poza agregatami (13 (2)% komórek CD28+ (N=3)) w agregatach nie wykryto komórek CD28+ (Tabela 5; fig.

nie stwierdzono istotnych różnic w częstości występowania i fenotypach podgrup limfocytów αβ-T pomiędzy agregatami w okrężnicy UC a samotnymi pęcherzykami w okrężnicy kontrolnej (ryc. 3).

większość komórek B w agregatach wyraża IgM na swojej powierzchni

większość komórek w obszarze komórek B agregatów wykazała zabarwienie przez anty-IgM MAB (42 (5)% komórek IgM+ (n = 4)), co odpowiada 95 (7)% CD19/20/22+ komórki. Jednakże Wykryto również nie mniej niż 19 (2)% komórek w agregatach wyrażonych IgA i niewielką część komórek IgG+ (3,3 (0,4)% (N=4)). Dane te sugerują, że komórki B w agregatach wyrażają więcej niż jeden izotyp immunoglobuliny i mogą ostatnio zostać poddane zmianie klas. Żadne komórki Ig+ nie wykazywały zabarwienia cytoplazmatycznego, co wskazuje, że komórki plazmatyczne nie były obecne w agregatach. Natomiast komórki plazmatyczne znaleziono poza agregatami.

komórki IgM+ (28 (2)% (n=4)) w pęcherzykach okrężnicy kontrolnej przeważały komórki IgA+(14 (1)% (n=4)) i IgG+ (2, 2 (0, 4)% (N=4)). Jednak suma komórek Ig+była równa liczbie CD19/20/22+ komórki w poszczególnych próbkach. Co ciekawe, chociaż nie stwierdzono istotnej różnicy w liczbie limfocytów B w mieszkach włosowych w porównaniu z agregatami (fig. 3), proporcja powierzchniowych komórek IgM+, powierzchniowych komórek IgA+ i powierzchniowych komórek IgG+była znacząco wyższa w agregatach jelita grubego UC niż w pęcherzykach jelita grubego kontrolnego (p<0,01 dla wszystkich trzech izotypów).

ekspresja nieograniczonych markerów podtypu w agregatach limfatycznych jelita grubego ZC

około 50% komórek w agregatach limfatycznych wyrażało marker pamięci/aktywacji CD45R0 (Tabela 5). Ponadto analiza wyizolowanych komórek LPL wykazała, że komórki wykazujące ekspresję CD45R0 i CD45RA stanowiły około 50% populacji (N = 4). Większość komórek CD3+ ulegała ekspresji CD45R0, ale znaczna część komórek cd45ra ulegała ekspresji CD3+ (ryc. 4). Większość komórek wykazujących ekspresję CD45R0 stanowiły komórki T, A 20-40% komórek CD45R0+ stanowiły komórki B. W dwóch próbkach suma komórek ekspresji CD45R0 i CD45RA przekroczyła 100%, co sugeruje, że komórki ekspresji obu wariantów splicingu mogą być obecne jednocześnie.

większość komórek wykazujących ekspresję MHC klasy II znajdowała się w obszarze limfocytów B, ale rozproszone komórki MHC klasy II były widoczne w obszarze limfocytów T (dane nie pokazane). Odsetek komórek wykazujących ekspresję HLA-DR wynosił około 50% (Tabela 5). W pięciu próbkach liczba komórek HLA-DR+ przekroczyła liczbę komórek B, co wskazuje, że niektóre komórki T w agregatach (31-89% komórek CD3+w tych pojedynczych próbkach) również wykazują ekspresję HLA-DR. podobne wyniki uzyskano w trzech próbkach analizowanych pod kątem ekspresji HLA-DQ (Tabela 5).

co ciekawe, integrynę aEß7, która jest obecna w dużej liczbie IEL w normalnych jelitach, wyrażono na 26 (13)% komórek w agregatach (fig. Komórki dodatnie wykazywały niejednorodną dystrybucję, w niektórych obszarach z wieloma komórkami dodatnimi, a w innych obszarach z kilkoma komórkami dodatnimi. Komórki aeekspresujące wykazywały zmienność intensywności barwienia (fig1C).

jedna trzecia limfocytów w agregatach wyrażała antyapoptotyczne białko bcl-2 (fig. Komórki ekspresji Bcl-2 zostały rozproszone po całym agregacie. W normalnych samotnych pęcherzykach stwierdzono około 10% komórek Bcl-2 dodatnich. Wszystkie znajdowały się w strefie limfocytów B.

analiza ULTRASTRUKTURALNA limfocytów tγδ w okrężnicy UC wykazała internalizację i obniżenie powierzchni TCR-γδ

badania w mikroskopie immunoelektronowym koncentrowały się na limfocytach tγδ w okrężnicy UC. W celach porównawczych zbadano również limfocyty tγδ w prawidłowej błonie śluzowej jelita grubego. TCR-γδ wykryto jako osady produktu reakcji gęstej elektronu.

w normalnym okrężnicy produkt reakcji rozprowadzano jednorodnie na powierzchni komórki wszystkich wykrytych limfocytów tγδ, zarówno na tych znajdujących się w lamina propria (fig.5A), jak i na wewnątrznabłonkowych limfocytach tγδ (fig. 5B).

natomiast limfocyty tγδ w okrężnicy UC wykazywały skrajną zmienność w dystrybucji produktu reakcji od powierzchni komórki do cytoplazmy. Zidentyfikowaliśmy pięć rodzajów wzorców barwienia (pięć morfotypów). limfocyty tγδ pierwszego typu (fig.6A) wykazały heterogeniczny rozkład produktu reakcji na powierzchni komórki. Niektóre wykazywały pojedyncze, pozytywnie zabarwione ciała wieloguzkowe. W limfocytach tγδ drugiego typu produkt reakcji był postrzegany jako rzadkie skupiska liniowe mniej lub bardziej losowo rozmieszczone na powierzchni komórki (fig. Ponadto, niektóre skupiska osadów lokowano nad i wewnątrz inwaginacji powierzchniowych, które różniły się od płytkich wgłębień do głębszych inwaginacji w kształcie kolby (fig. Nie było możliwości zastosowania dodatkowych przeciwbarwień. Tak więc, chociaż niektóre inwazje powierzchniowe przypominały powleczone wgłębienia, nie mogliśmy ustalić, czy te inwazje były powleczone. W limfocytach tγδ trzeciego typu produkt reakcji lokowano w postaci klastrów powierzchniowych komórek, a także w cytoplazmatycznych wakuolach o cechach morfologicznych endosomów (fig. W limfocytach tγδ czwartego typu produkt reakcji był obficie obecny w cytoplazmie, ale ledwo wykrywalny na powierzchni komórki (fig. Produkt reakcji zabarwił liczne pęcherzyki cytoplazmatyczne i wakuole w pobliżu błony komórkowej, a także głęboko w komórkach w pobliżu jądra. Dodatnio zabarwione pęcherzyki były czasami widoczne w ciągłości z błoną plazmatyczną i przypominały pęcherzyki pokryte powłoką (fig. Wybarwiono również liczne wieloguzkowe ciała składające się ze szczelnie upakowanych mikrowłókienek (ryc. 6F). limfocyty tγδ piątego typu występowały rzadko (fig. Morfotyp ten wykazywał zwykle silne dodatnie zabarwienie błony plazmatycznej i przestrzeni okołopojądrowej. Czasami produkt reakcji barwione różne cytoplazmatyczne wakuole o różnych rozmiarach i kształtach. Nie zaobserwowano wyraźnej różnicy pomiędzy poszczególnymi badanymi próbkami jelita grubego.

podsumowując, większość limfocytów tγδ (morfotypy 1-4) w okrężnicy UC wykazywała komórkową lokalizację produktu reakcji najprawdopodobniej odzwierciedlającą różne kolejne etapy internalizacji TcR: tworzenie klastrów, powlekanych dołów, powlekanych pęcherzyków, endosomów i ciał wielowątkowych.30 niewielka liczba komórek (morfotyp 5) wykazała aktywną syntezę cząsteczek TCR-γδ.