Haavaisen koliitin limakalvojen lymfaattisen aggregaatin kuvaus: immuunisolujen fenotyyppi ja TCR-γδ ekspressio | Gut

tulokset

leukosyytit muodostavat pääasiallisen solutyypin UC-potilaiden tulehtuneessa paksusuolessa ja jakaantuvat eri tavoin koolonin limakalvolla verrattuna kontrolliryhmään

kaksitoista näytettä tulehtuneesta sigmoidisesta paksusuolesta UC-potilailta ja 15 näytettä ilmeisesti normaalista sigmoidisesta paksusuolesta potilailta, joilla ei ole ollut IBD: tä fenotyyppianalyysi immunohistokemialla. Näistä UC-näytteistä yhdeksän luokiteltiin vaikeasti sairaiksi. Näissä epiteeli oli litistynyt ja siinä oli harventuneita pikarisoluja, haarautuneita hautakammioita ja satunnaisia haavaumia. Kryptapesäkkeet olivat yleisiä. Lamina propriassa oli lukuisia hajallaan olevia leukosyyttejä sekä basaalilymfoidisia aggregaatteja (kuva 1A). Kolme UC-yksilöä luokiteltiin kohtalaisen sairaiksi. Kaikissa epiteeli oli ehjä ja hieman vähentynyt määrä pikarisoluja ja ei / muutamia haarautuneita kryptoja. Lamina propriassa oli enemmän leukosyyttejä ja lymfaattisia aggregaatteja. Morfometrinen analyysi keskittyi aggregaatteihin.

aggregaatit koostuivat nodulaarisista lymfosyyttien rykelmistä, joilla ei ollut tyypillisiä reaktiivisia keskuksia. Ne sijaitsivat kryptan ja submukoosan pohjien välissä ilman näkyvää kosketusta luminaaliepiteeliin (kuva 1A). Kuitenkin, lähellä solujen aggregaattien ja kryptan epiteelin havaittiin usein (kuva 1A, D). Aggregaattien esiintymistiheys (lukumäärä/pinta-ala) oli sama keskivaikeasti ja vakavasti sairaassa kudoksessa, 1,3-4,9 aggregaattia lamina proprian mm2: ta kohti (taulukko 3). Aggregaattien käyttämän lamina proprian pinta-ala kuitenkin kasvoi taudin vakavuuden myötä ja muodosti joiltakin potilailta jopa 45 prosenttia vaikeasti sairaassa paksusuolessa olevasta lamina propriasta (taulukko 3). Normaalit yksinäiset follikkelit verrokkikolonissa olivat harvinaisia (alle 0, 1 follikkelia/mm2 lamina propriaa, n=8).

noin 75% aggregaattien soluista oli leukosyyttejä (74 (7)% CD45+ – soluja (n = 9)). Myös leukosyyttien osuus yksittäisissä lymfoidisissa follikkeleissa oli suuri (67 (6)% CD45+ – soluista (n=8)). Molemmat arvot voidaan aliarvioida, koska anti-CD45 mAb-värjäytyminen oli epäyhtenäistä. Tämä heterogeeninen värjäytyminen voi selittyä ainakin osittain CD45: n vähentyneellä ilmentymisellä aktivoiduissa B-soluissa.

leukosyyttien määrä sekä lamina-propriassa aggregaattien ulkopuolella (26 (7)% CD45+ – solua (N=4)) että submukoosassa (8 (2)% CD45+ – solua (N=4)) lisääntyi UC-paksusuolessa verrattuna normaaliin paksusuoleen (15 (2)% CD45+ – solua lamina-propriassa munarakkuloiden ulkopuolella ja 4 (2)% CD45+ – solua submukosassa (N=4)).

Intraepiteelisiä leukosyyttejä esiintyi harvemmin UC-paksusuolessa kuin normaalissa paksusuolessa: 28 (7) CD45+ – solua/1000 epiteelisolua vaikeasti sairaassa paksusuolen kudoksessa (n=4) verrattuna 66 (26) CD45+ – soluun/1000 epiteelisoluun kontrolleissa (n=4, p=0, 03). IEL havaittiin pääasiassa kryptaaliepiteelissä UC-paksusuolessa, osittain luminaalin pintaepiteelin eroosion vuoksi. Normaalissa paksusuolessa >60% IEL: stä sijaitsi luminaaliepiteelissä. Koska IEL: n tiheys on siis pienempi kryptaalisessa kuin luminaaliepiteelissä normaalissa paksusuolessa, IEL: n pienempi frekvenssi UC-paksusuolessa voi selittyä sillä, että UC-paksusuoli sisältää pääasiassa kryptaalista epiteeliä.

UC-potilaiden KOOLONKUDOKSEN aggregaatit käsittävät lähes yksinomaan t-ja B-lymfosyyttejä

aggregaatit analysoitiin lymfosyyttien kolmen päätyypin esiintymisen varalta: T-solut (anti-CD3 mAb), B-solut (Anti-CD19, anti-CD20 ja anti-CD22 mAbs) ja NK-solut. NK-solujen analysointiin valittiin anti-CD57 mAb, koska olemme aiemmin osoittaneet, että ihmisen suolistossa on αβ-ja γδ T-soluja, jotka ilmentävät klassista NK-solumarkkeria CD56.Anti-CD15: tä käytettiin granulosyyttien osoittamiseen, anti-CD14: ää veren monosyytteihin/äskettäin rekrytoituihin makrofageihin ja anti-CD68: aa kudoksen makrofageihin. Follikulaaristen dendriittisolujen (FDC) osoittamiseen käytettiin kolmea eri mAbs-menetelmää (taulukko 2). Anti-CD80 / B7.1: tä käytettiin antigeenia esittävien solujen havaitsemiseen ja anti-CD1a: ta käytettiin ylimääräisenä merkkiaineena Dendritic/Langerhans-soluissa. Immunomorfometrisen analyysin tulokset esitetään yhteenvetona kuvassa 3. Kaksi tärkeintä solutyyppiä olivat T-ja B-solut sekä CD3+ – solujen ja CD19: n summa/20/22+solut vastasivat CD45+ – solujen määrää useimmissa näytteissä (77 (12)% verrattuna 74 (7)%: iin CD45+ – soluista (n=9)). T-ja B-solut muodostivat yhtä suuren osan aggregaattien soluista. Aggregaatit sisälsivät laajoja T-solualueita, joissa ei ollut B-soluja, ja B-solujen hallitsemia vastavuoroisia alueita, joissa oli vain muutama hajanainen T-solu (kuva 2A, B). Suurin osa aggregaateista koostui tiheästi pakatuista soluista, mutta joissakin tapauksissa B-soluvyöhykkeellä havaittiin niukasti väljemmin pakattuja soluja. B-solujen osuus oli huomattavasti suurempi vaikeasti sairaiden UC-paksusuolen aggregaateissa verrattuna kohtalaisen sairaaseen kudokseen (43 (8)v 30 (6); p=0, 03), mikä viittaa B-solujen lisääntyneeseen merkitykseen taudin vaikeissa muodoissa. Normaalin paksusuolen yksinäiset munarakkulat olivat hieman erinäköisiä. Follikkelin keskellä oli löyhästi pakkautuneita suuria B-soluja, joissa oli vain vähän jos lainkaan T-soluja, ja sitä ympäröi sekä B-että T-solujen vyöhyke ja reuna-alueet, jotka sisälsivät vain T-soluja (kuva 2D, E).

follikulaarisia dendriittisoluja havaittiin seitsemässä yhdeksästä UC-näytteestä, joissa käytettiin kolmea eri anti-FDC-MAB: ta. Kolmen Mabin välillä ei havaittu eroa värjäyskuvioissa. Positiivisesti värjäytyneet follikulaariset dendriittisolut muodostivat verkoston, joka sijaitsi aggregaattien B-solualueella (kuva 2B, C). Vaikka jokainen aggregaatti sisälsi vähintään yhden B-solualueen, vain noin 40% sisälsi FDC-verkon. FDC-verkkoja ei koskaan nähty t-solualueilla. Normaalissa paksusuolessa jokainen follikkeli sisälsi FDC-verkon, joka rajoittui B-solun alueelle (kuva 2e, F). CD80/B7.1 + dendriittisoluja oli myös UC-paksusuolen aggregaateissa. Ne nähtiin yleisimmin yksittäisinä dendriittisoluina, joita ympäröivät lymfosyyttien väliset pienet CD80+ – pisteet, oletettavasti dendriittisten ulokkeiden poikkileikkaukset. Toisinaan voitiin nähdä täydellinen cd80+ – solujen verkosto (kuva 1e). Tämä verkko sijaitsi t-solualueella. Aggregaateissa ei havaittu CD1a+ – soluja, joiden morfologia olisi dendriittinen.

vaikka granulosyyttien, CD15+ – solujen, osuus oli kohonnut useimmissa UC-näytteissä, tällaiset solut sijaitsivat yleensä aggregaattien ulkopuolella (kuva 3). Laminan propriassa oli aggregaattien ulkopuolella lukuisia kudosmakrofageja, CD68 + – soluja. Kiviaineksissa niitä oli vähän ja ne sijaitsivat ulkoreunalla (kuva 3). Normaalissa paksusuolessa useimmat CD68 + – solut sijaitsivat luminaaliepiteelin läheisyydessä.Vain kahdessa näytteessä havaittiin 29 aggregaattia, joissa oli merkittävä määrä CD14+ – soluja. Näissä näytteissä oli myös runsaasti CD14+ – soluja submukosassa (toisin sanoen ≈3,5% CD14+ – soluja verrattuna ≈1% CD14+ – soluja muihin UC-kaksoispisteen näytteisiin ja kontrollipisteeseen). Lisäksi CD14 + – solut keskittyivät verisuonten lähelle, mikä viittaa jatkuvaan monosyyttien invaasioon. Ei ollut selvää kliinistä parametria, joka selittäisi monosyyttien invaasion, erityisesti näissä kahdessa näytteessä. NK-solut, CD57 + – solut, olivat harvinaisia sekä UC: ssä että normaalissa paksusuolen kudoksessa, ja niitä havaittiin vain satunnaisesti aggregaateissa (fig3).

UC-koolonin lymfaattinen aggregaatti ei eronnut merkitsevästi normaalin koolonin yksinäisistä munarakkuloista T-solujen, B-solujen, makrofagien/monosyyttien, granulosyyttien ja NK-solujen määrän osalta (kuva 3). Lisäksi B-soluvyöhykkeellä sijaitseva FDC-verkko näkyi molemmissa rakenteissa. Aggregaateista puuttui kuitenkin tyypillinen itukeskuksen kaltainen B-soluvyöhyke, jossa on löyhästi pakkautuneita B-soluja, mikä näkyy normaaleissa yksinäisissä munarakkuloissa. Lisäksi UC Colonin kiviaineksen osuus lamina propriasta oli jopa 45 prosenttia.

aggregaatteja UC-kaksoispisteessä kolonisoivat γδ T-solut

yllättävän suuri osa aggregaattien soluista oli γδ T-soluja (11 (7%) TCR-γδ+ – soluja (N=9)) (kuva 1B,3). Sen sijaan normaalin paksusuolen munarakkuloissa (0, 3 (0.3)% TcR-γδ+ soluja (n=8) (p<0, 001)) (kuva 3). TCR-γδ+ – solujen määrä aggregaateissa kasvoi taudin vakavuuden myötä. Aggregaattien TCR-αβ+-solujen ja TCR-γδ+ – solujen suhde oli 2, 4 (0, 9) vaikeasti sairaissa UC-näytteissä (n=6), mutta vaihteli 1, 3: sta 42: een kohtalaisen sairaissa näytteissä (n=3) ja oli >300 normaaleissa paksusuolen follikkeleissa. Viidestä näytteestä määritettiin γδ T-solujen frekvenssit sekä aggregaateissa että lamina propriassa aggregaattien ulkopuolella. Aggregaateissa TcR-γδ+ – solujen taajuus oli 3,9 (2.5) kertaa suurempi kuin aggregaattien ulkopuolella. Aggregaattien TCR-γδ+ – solut ilmaisivat pääasiassa Vδ1: tä, kun taas useimmat vδ2: ta käyttävät solut löytyivät aggregaattien ulkopuolelta. Koko LPL-fraktio analysoitiin vδ-geenin käyttöä varten immunoflow-sytometrialla eristetyissä soluissa. Yhdessä immunohistokemiallisten tulosten kanssa 86 (10)% TCR-γδ+ – soluista ilmaisi Vδ1, kun taas loput solut ilmaisivat Vδ2 (taulukko 4). Γδ+ T-solujen ultrarakenteellisen analyysin (KS.alla) mukaisesti TCR-γδ+ – solujen värjäytyminen oli usein hajanaista tai pilkullista immunohistokemian osalta (kuva 1B, pikkukuva) ja osoitti suhteellisen alhaisen fluoresenssin intensiteetin immunoflow-sytometriassa (kuva 4). TCR-γδ: n heterogeenisen värjäyskuvion vuoksi γδ+ T-solujen määrä voi olla aliarvioitu. Eristetyn LPL: n kahden väri-immunoflow-sytometrianalyysi osoitti, että lähes kaikki γδ+ T-solut ilmaisivat CD45R0: tä. Jopa 15% γδ+ T-soluista ilmaisi CD8: aa, mutta useimmat γδ + T-solut olivat CD4/CD8-kaksoisnegatiivisia.

CD4+CD28-cd28-αβ T-solut ovat tärkein T-solun alatyyppi aggregaateissa

suurin osa aggregaattien T-soluista ilmaistuna TCR-αβ: na ja CD4+ – solujen osuus oli suurempi kuin CD8+ – solujen osuus (kuva 3), ja keskimääräinen CD4/CD8-suhde oli 1,7 (0.7) (n=8). CD4+ – solujen määräävä asema korostui entisestään, kun analysoitiin eristettyä LPL-arvoa (kuva 4). LPL: n kahden väri-immunoflow-sytometrianalyysi osoitti, että lähes kaikki CD4+-solut ilmaisivat TCR-αβ: ää (tietoja ei näy). CD8+ – soluja löytyi vain aggregaattien T-solun alueelta, kun taas CD4 + – soluja oli sekä T-solun alueella että hajallaan B-solun alueella. Useissa näytteissä CD4+ – ja CD8+ – solujen summa ylitti CD3+ – solujen ja/tai TcR+ – solujen määrän. Tämä johtuu todennäköisesti T-solujen aliarvioinnista CD3/TCR-kompleksin alhaisen ilmentymistason vuoksi eikä KAKSOISPOSITIIVISTEN CD4/CD8-solujen esiintymisestä, sillä immunoflow-sytometrianalyysissä vain 2, 4 (1, 3)% (n=4) LPL: n kokonaismäärästä oli kaksoispositiivisia (kuva 4). Vaikka lukuisia T-solun koreseptoria CD28 ilmentäviä soluja oli hajallaan lamina propriassa aggregaattien ulkopuolella (13 (2)% CD28+ – soluja (n=3)), cd28+ – soluja ei havaittu aggregaateissa (taulukko 5; kuva 1D).

αβ T-solujen alaryhmien esiintymistiheyksissä ja fenotyypeissä ei ollut merkittäviä eroja UC-koolonin aggregaattien ja kontrollikolonin yksinäisten munarakkuloiden välillä (kuva 3).

useimmat aggregaattien B-solut ilmentävät IgM: ää pinnallaan

suurin osa aggregaattien B-solualueen soluista värjäytyi anti-IgM mAb: llä (42 (5)% IgM+ soluja (n=4)), mikä vastaa 95 (7)% CD19: stä/20/22+ sellejä. Kuitenkin peräti 19 (2)% aggregaattien soluista ilmaistuna IgA: na ja pieni osa IgG+ – soluista (3,3 (0,4)% (n=4)) havaittiin myös. Nämä tiedot viittaavat siihen, että aggregaattien B-solut ilmentävät useampaa kuin yhtä immunoglobuliini-isotyyppiä, ja ne ovat saattaneet hiljattain vaihtaa luokkaa. Yhdessäkään Ig + – solussa ei havaittu sytoplasmavärjäystä, mikä viittaa siihen, että aggregaateissa ei ollut plasmasoluja. Sen sijaan aggregaattien ulkopuolelta löytyi plasmasoluja.

IgM+ soluja (28 (2)% (n=4)) alakynnessä IgA+ – soluja (14 (1)% (n=4)) ja IgG+ – soluja (2, 2 (0, 4)% (N=4)) kontrollikolonin munarakkuloissa. IG+ – solujen summa vastasi kuitenkin CD19: n määrää/20/22+ yksittäisten näytteiden solut. Vielä mielenkiintoisempaa on, että vaikka B-solujen määrässä ei ollut merkitsevää eroa aggregaatteihin verrattuna (kuva 3), Pinta-IgM+ – solujen, pinta-IgA+ – solujen ja pinta-IgG+ – solujen osuus oli merkitsevästi suurempi UC-koolonin aggregaateissa kuin kontrollikolonin munarakkuloissa (p<0, 01 kaikilla kolmella isotyypillä).

rajoittamattomien alatyypin merkkiaineiden ilmentyminen UC-kaksoispisteen LYMFAGGREGAATEISSA

noin 50% lymfaattisen aggregaatin soluista ilmaisi muisti/aktivaatiomerkin CD45R0 (taulukko 5). Lisäksi eristettyjen LPL-solujen analyysi osoitti, että cd45r0-ja CD45RA-soluja ilmentävät solut muodostivat kumpikin noin 50% populaatiosta (n=4). Suurin osa CD3+ – soluista ilmaisi CD45R0: tä, mutta merkittävä osa cd45ra-soluista ilmensi CD3 + – soluja (kuva 4). Suurin osa cd45r0-ilmentävistä soluista oli T-soluja ja 20-40% CD45R0+ – soluista B-soluja. Kahdessa näytteessä cd45r0: n ja CD45RA: n ilmentävien solujen summa ylitti 100%, mikä viittaa siihen, että molempia liitosvariantteja ilmentäviä soluja voi esiintyä samanaikaisesti.

suurin osa MHC-luokan II ilmentävistä soluista sijaitsi B-solun alueella, mutta hajanaisia MHC-luokan II positiivisia soluja havaittiin T-solun alueella (tiedot eivät näy). HLA-DR: ää ilmentävien solujen osuus oli noin 50% (taulukko 5). Viidessä näytteessä HLA-DR+-solujen määrä ylitti B-solujen määrän, mikä osoittaa, että jotkin T-solut aggregaateissa (31-89% CD3+ – soluista näissä yksittäisissä näytteissä) ilmentävät myös HLA-DR. samansuuntaisia tuloksia saatiin kolmesta näytteestä, jotka analysoitiin HLA-DQ-ilmentymäksi (taulukko 5).

mielenkiintoista on, että integriini aEß7, jota esiintyy suuressa määrässä suolen normaalielämää, ilmaistiin 26 (13) prosentissa aggregaattien soluista (kuva 1C, taulukko 5). Positiiviset solut jakautuivat heterogeenisesti, joillakin alueilla oli paljon positiivisia soluja ja toisilla alueilla vähän positiivisia soluja. AEexpressing-solut osoittivat värjäyksen voimakkuuden vaihtelua (fig1C).

kolmasosa aggregaattien lymfosyyteistä ilmaisi antiapoptoottista proteiinia bcl-2 (kuva 1F, taulukko 5). BCL-2 ilmentävät solut olivat hajallaan koko aggregaatin. Normaaleissa yksinäisissä munarakkuloissa havaittiin noin 10% BCL-2-positiivisia soluja. Ne kaikki sijaitsivat B-solualueella.

γδ T-solujen ULTRARAKENTEELLINEN analyysi UC-paksusuolessa osoittaa TCR-γδ

immunoelektronimikroskopiatutkimus keskittyi γδ T-soluihin UC-paksusuolessa. Vertailutarkoituksiin analysoimme myös γδ T-soluja normaalissa paksusuolen limakalvossa. TCR-γδ havaittiin elektronin tiheän reaktiotuotteen talletuksina.

normaalissa paksusuolessa reaktiotuote jakautui homogeenisesti kaikkien havaittujen γδ T-solujen solupinnalle sekä lamina-propriassa (kuva 5A) että intraepiteelisissä γδ T-soluissa (kuva 5B).

sen sijaan UC-paksusuolen γδ T-soluissa ilmeni äärimmäistä vaihtelua reaktiotuotteen jakautumisessa solun pinnalta sytoplasmalle. Tunnistimme viisi värjäyskuviotyyppiä (viisi morfotyyppiä). ensimmäisen tyypin γδ T-solut (kuva 6A) osoittivat reaktiotuotteen heterogeenisen jakautumisen solun pinnalla. Joillakin näytteillä oli yksittäisiä positiivisesti värjäytyneitä multivesikulaarisia kappaleita. Toisen tyypin γδ T-soluissa reaktiotuote nähtiin niukoina lineaarisina klustereina, jotka jakautuivat enemmän tai vähemmän satunnaisesti solun pinnalle (kuva 6B). Lisäksi jotkin kerrostumat sijaitsivat pinnallisten invaginaatioiden päällä ja sisällä, jotka vaihtelivat matalista kuopoista syvempiin kolvinmuotoisiin invaginaatioihin (kuva 6B, pikkukuva). Lisävastustaminen ei ollut mahdollista. Niinpä vaikka jotkut pinnan invaginations muistutti pinnoitettu kuoppia, emme voineet määrittää, onko nämä invaginations oli päällystetty. Kolmannen tyypin γδ T-soluissa reaktiotuote sijaitsi solujen pintaryppäinä ja myös sytoplasmaisissa vakuoleissa, joilla oli morfologisia ominaisuuksia endosomeissa (kuva 6C). Neljännen tyypin γδ T-soluissa reaktiotuote oli runsaasti sytoplasmassa, mutta tuskin havaittavissa solun pinnalla (kuva 6D, E, F). Reaktiotuote värjäsi lukuisia sytoplasmarakkuloita ja vakuoleja solukalvon lähellä ja myös syvällä tuman lähellä olevissa soluissa. Positiivisesti värjäytyneitä vesikkeleitä nähtiin joskus plasmakalvon jatkuvuudessa ja ne muistuttivat Pinnoitettuja vesikkeleitä (kuva 6E). Myös lukuisia tiiviisti pakatuista mikrovesikkeleistä koostuvia multivesikulaarisia kappaleita värjättiin (kuva 6F). viidennen tyypin γδ T-solut olivat harvinaisia (kuva 6G, H). Tässä morfotyypissä plasmakalvon ja perinukleaarisen tilan värjäytyminen oli yleensä voimakasta. Joskus reaktiotuote värjäsi erilaisia, erikokoisia ja-muotoisia sytoplasmaisia vakuoleja. Yksittäisissä tutkituissa UC-paksusuolen näytteissä ei havaittu selvää eroa.

yhteenvetona voidaan todeta, että suurimmalla osalla γδ T-soluista (morfotyypit 1-4) UC-paksusuolessa ilmeni reaktiotuotteen solupaikkaantumista, mikä todennäköisesti heijasti TCR: n internalisoitumisen eri peräkkäisiä vaiheita: klusterien, pinnoitettujen kuoppien, pinnoitettujen rakkuloiden, endosomien ja multivesikulaaristen kappaleiden muodostumista.30 pieni määrä soluja (morfotyyppi 5) osoitti aktiivista synteesiä TCR-γδ-molekyyleistä.