LC3-pozitivní struktury jsou prominentní v autofagie-deficientní buňky

Materiály

protilátky použité v této studii jsou: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) a všechny sekundární protilátky konjugované Alexa byly zakoupeny od Invitrogen. Konstrukce pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A a RFP-LC3 byly laskavými dary od Dr. T. Yoshimoriho (Osaka University, Japonsko). ATG9A-pEGFP byl jakýsi dar od Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry byl z Clontech (632524), mCherry-p62 a mCherry-p62 LIR mutant (DDDW335-338AAAA) byl druh dar od Dr. Sascha Martens (University of Vienna, Rakousko), p62-pEGFP byl jakýsi dar od Dr. Terje Johansen (Artic Univerzita, Norsko), zatímco Myc-LC3-G120A-ΔC22 byl dar od Dr. T. Yoshimori (Addgene plasmid # 45449). Pspcas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 byl dar od Dr. F. Zhang (Addgene plasmid # 62988). pCMV-ATG7 byl laskavý dárek od Dr. Isei Tanidy. EGFP-LC3K51A a EGFP-LC3F52A byly vytvořeny stránky mutageneze pomocí Q5 Site-Directed Mutageneze kit (NEB E0554S) a pEGFP-LC3 jako šablonu, podle pokynů výrobce. Primery používané pro mutaci k51a: 5′ – ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3′ a pro mutaci F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Buněčné kultury

HeLa buňky byly kultivovány v Dulbecco ‚ s Modified Eagle Medium (DMEM) doplněném 10% v/v fetálního bovinního séra, 100 U/ml penicilin-streptomycinu a 2 mM L-glutamin. Buňky HepG2 byly udržovány v médiu RPMI 1640 doplněné o 10% v/v fetální bovinní sérum, 100 U / ml penicilin-streptomycin, všechny získané od Sigma, UK. Buněčné linie byly udržovány passaging buněk, pomocí Trypsin-EDTA roztoku (Sigma), poté, co jsou sub-splývající kolem 75-90% v T75 (75 cm2 plochy) baňky (Falcon). Buněčná linie použitá pro tuto studii byla buněčná linie HeLa (Human cervic cancer cells). V pokusech, kde jsme potřebovali blokovat autophagic tok, buňky byly ošetřeny s 400 nM bafilomycin A1 po dobu 4 hodin při 37 °C.

Transfekci

HeLa buňky byly transfektovaly s purifikován plazmid pomocí Mirus TransIT-2020 transfekci činidlem. Transfekce byla provedena pomocí optiMEM medium, za použití protokolu výrobce. Krátce byla připravena směs 100 µl optimemu s 1 µg DNA a inkubována při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Byla připravena další směs obsahující 100 µl optimemu s 5 µl Mirusu a inkubována po dobu 5 minut. Oba roztoky byly poté smíchány dohromady a inkubovány přibližně 20-25 minut. Celkový objem byl poté přidán do jedné jamky 6-jamkové desky, která již obsahovala 1 ml optimemu. Množství DNA obecně používané pro transfekci bylo 1 µg pro 6 jamek.

knockdown zprostředkovaný siRNA

buňky pro knockdown siRNA byly transfekovány pomocí transfekčního činidla lipofektaminu 2000. Transfekce byla provedena pomocí optiMEM medium, za použití protokolu výrobce. Krátce byla připravena směs 100 µl optimemu s 3 µl 20 µM nebo 1 µl 100 µM siRNA a inkubována při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Současně byla připravena další směs obsahující 100 µl optimemu s 5 µl Lipofektaminu 2000 a inkubována po dobu 5 minut. Oba roztoky byly poté smíchány dohromady a inkubovány přibližně 20-25 minut. Celkový objem byl pak přidán do jedné jamky 6-deska, již obsahující 1 ml optiMEM po dobu 4 hodin při 37 °C. Po inkubaci byla média změněna a nahrazena plnými médii. Buňky byly poté sklizeny po 48 hodinách inkubace pokud jeden knockdown (KD) byla žádoucí, jak pro ATG7 a ATG10 KD v HeLa buňkách. Pro záchranné experimenty ATG7 a ATG10, pcDNA.3 (prázdný vektor) nebo ATG7 plus ATG10-FLAG byly použity k transfekci buněk 24 hodin po transfekci siRNA. Pro dvojité studie KD jsme provedli další kolo transfekce siRNA podle stejného protokolu, jak je uvedeno výše, po prvním kole (pro studie p62 KD). Pro siRNA poražený v HepG2 buňkách, tyto byly transfektovaly pomocí Lipofectamine RNAi max transfekci činidlem pomocí 100 nM konečné siRNA a dvě kola siRNA transfekce byly provedeny k dosažení efektivní poražený. Buňky byly poté rozděleny a naočkovány na příslušné desky nebo krycí lišty pro další experimenty. Míchaná siRNA (NA-TARGETplus Non-cílení Bazén, D-001810-10), lidská ON-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), člověka NA-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), člověka NA-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) byly objednány z Dharmacon a používá se na konečnou koncentraci 50-100 nM.

ONZP-past testy

HeLa buňky byly transfektovaly s EGFP-LC3 pomocí Mirus TransIT-2020 transfekci činidlem a 24 hodin později byli lyžují v lyzačního pufru (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mm EGTA) po dobu 10 minut na ledu a peletováno po dobu 10 minut při 13 000 ot / min. Proteiny označené GFP (EGFP nebo EGFP-LC3) byly staženy pomocí kuliček GFP-TRAP (ChromoTek) podle protokolu výrobce. Imunoprecipitáty byly eluovány vařením vzorků v laemmli pufru po dobu 5 minut. Proteiny byly vyřešeny SDS-PAGE.

imunofluorescence

imunocytochemie byla provedena na buňkách pěstovaných na krytech 22 × 22 mm. HeLa buňky byly pěstovány na konfluence 70-80%, jednou prané s PBS a potom se připevní buď za použití 4% w/v PFA po dobu 5-7 minut, nebo za studena-methanolu po dobu 3-5 minut při 4 °C. vezměte Prosím na vědomí, že vzhledem k tomu, většina protilátek používaných v této studii pracovali pouze po fixaci PFA, vzorky byly obecně stanoveny s 4% w/v PFA v PBS pokud není jinak uvedeno na obrázku legenda(y). PFA byla zlikvidována v souladu s bezpečnostními předpisy a buňky byly třikrát promyty PBS. Buňky byly poté permeabilizovány pomocí 0.5% v / v Triton X-100 po dobu 5-7 minut a třikrát se promyje PBS, aby se odstranil veškerý zbytkový prací prostředek. Roztok obsahující 1% w/v BSA byl pak přidán do coverslips, jako blokování řešení, ke snížení nespecifické vazby primární a sekundární protilátky, a držel po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Blokovací roztok byl poté odebrán z krycích skel a primární protilátky byly při vhodných ředěních přidány na krycí sklíčka. Krycí vrstvy s primárními protilátkami byly inkubovány při 4 °C po dobu 16-20 hodin ve vlhké a vlhké komoře. Krycí sklíčka byla dále třikrát promyta PBS a inkubována roztokem obsahujícím sekundární protilátky po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. (Všimněte si, že primární a sekundární roztoky protilátek byly vyrobeny v blokujícím pufru.) Ředění sekundárních protilátek použitých pro tuto studii bylo 1: 400 připravené v 1% hmotnostním roztoku BSA. Nakonec byly kryty dvakrát omyty PBS a sterilní vodou s vysokou čistotou a namontovány na skleněné sklíčka pomocí pro-Long gold Anti-fade DAPI montážního média (Invitrogen, US). Krycí lišty byly poté zobrazeny pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM880 nebo LSM780 pomocí cíle ponoření oleje 63x.

zobrazování živých buněk

atg16l1-knockout buňky byly naočkovány na mattekovo nádobí (MatTek, Ashland MA USA). Následující den byly tyto buňky transfektovány vhodným plazmidem na základě experimentálních požadavků s použitím transfekčního činidla Mirus Trans-it 2020. Transfekce byla provedena pomocí optiMEM medium, za použití protokolu výrobce. Poté byl použit 2% zásobní roztok Triton X-100 k dosažení určené koncentrace pro extrakci detergentu plazmatické membrány. Konečná koncentrace 1% Triton X-100 je schopna extrakci cytosolické a membránové vazby. Experiment k potvrzení přítomnosti p62 agregáty v ATG16L1-knockout buňky, nicméně, podílí se saponátem extrakce pomocí 1.5% Triton X-100 jako finální koncentrace na předmět buňky tvrdší podmínky extrakce. Zobrazovací pak byla provedena pomocí Časových řad‘ modul na inkubovány Zeiss AxioObserver Z1 mikroskop s LSM780 konfokální mikroskop pomocí 63 × 1.4 NA Plan Apochromat oil-immersion lens.

Super-resolution mikroskopie

Vzorky byly naočkovány na Zeiss Vysoká přesnost Č. 1.5 170+ nebo -5 µm, 18 mm x 18 mm coverslips. Po barvení byly vzorky namontovány v pro-Long gold Anti-fade DAPI montážním médiu (Life Technologies) a ponechány ztvrdnout po dobu 3 dnů, aby dosáhly konstantního indexu lomu (RI) 1,46. Vzorky byly zobrazovány pomocí strukturovaného osvětlení na Elyra PS1 (mikroskopie Carl Zeiss). Následující fáze zarovnání, laserové linky 405, 488 a 561 nm byly použity k obrazu korálek zásobníku v pořadí ke korekci chromatické aberace pomocí kanálu zarovnání algoritmus. Z-stohy byly získány v 5 fázích a 5 otáčkách osvětlovací mřížky a následně zpracovány a zarovnány pomocí softwaru ZEN Black Elyra edition (mikroskopie Carl Zeiss).

Extrakce rozpustné a nerozpustné frakce

extrakce rozpustné a nerozpustné frakce z ATG16L1-knockout buněk byla provedena v RIPA pufru. Stručně řečeno, buňky byly promyty s 1X led-studená PBS jednou a byl poškrábaný, lyžují v 500 µl RIPA pufru a shromažďovány v označené zkumavky uchovávány na ledu. Složení RIPA pufru bylo takto –

RIPA pufru

50 mM Tris-HCl (pH 7.4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% deoxycholát Sodný

0.1% SDS

V době použití, RIPA pufr byl doplněn kompletní proteázy tablet (1 tableta na 50 ml) a fosfatáza inhibitor koktejly 2 a 3 (1:100).

lyzáty byly následně prošel 25 G jehla 10 krát, a pak řešení byla centrifugována při 14000 rpm po dobu 15 minut při 4 °C. Po centrifugaci, supernatant byl odebrán do čisté mikrozkumavky a byl označen jako rozpustné frakci a byl smíchán s 300 µl 2X Laemmli pufru a byla vaří po dobu 5 minut. Peleta získaná po centrifugaci sestává z nerozpustné frakce a byla resuspendována a promyta 500 µl RIPA pufru. Resuspendované řešení pak byla centrifugována při 14000 rpm po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. supernatant byl odstraněn a pelety byly resuspendovány ve 100 µl roztoku MOČOVINY + RIPA pufru. To bylo nakonec smícháno se 100 µl 2x laemmli pufru a bylo vařeno po dobu 5 minut. Složení močovinového + RIPA pufru sestává z další močoviny v konečné koncentraci 2 M spolu se složkami RIPA pufru.

Western blot

Buňky kultivované v 6-no desky byly roztrhli a shromažďovány v 2X Laemmli pufru (4% w/v SDS, 20% v/v, glycerol, 10% v/v 2-merkaptoethanolu, 0.004% w/v bromfenolová modř a 125 mM Tris HCl, pH 6.8). Poté byly buňky roztrhli, 20-30 µl vzorky byly vloženy do 10-no, 12-15% SDS-PAGE a běh na 100 až 120 V. standardní M. W. žebřík byl vložen spolu s vzorky tak, aby sledovat pohyb proteinů v gelu. Proteiny byly poté přeneseny na aktivovaný PVDF při 100 V po dobu 60 minut. Membrány byl odstraněn na dokončení převodu a byl namočeným v 5% w/v, sušené odstředěné mléko zablokovat nespecifická vazebná místa, po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Další, řešení obsahující specifické primární protilátky (připravené v 5% w/v, sušené odstředěné mléko) ve vhodném ředění bylo přidáno na membrány pro inkubace přes noc při 4 °C. membrány byly poté promyty třikrát s PBST (Phosphate buffer saline +0.1% Tween-20) před přidáním sekundární protilátky. Sekundární protilátka, připravená také v 5% hmotnostních odstředěného mléka, byla inkubována s membránou po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Ředění sekundární protilátky byla obecně udržována na 1:4000 pro zesílené chemiluminiscence (ECL) HRP-konjugované protilátky a 1:5000 pro LICOR fluorophore-konjugované protilátky. Membrány byly poté znovu promyta PBST několikrát a vyvinut za použití směsi stejných objemů vývoji řešení 1 a 2 pro ECL nebo zachycen přímo pro fluorescenční signál detekce pomocí LICOR Image Studio software (LICOR, USA).

CRISPR knockout cell generation

vodicí RNA byly navrženy pro generování atg9 knockout buněk pomocí online nástroje vyvinutého Zhang Lab21. První tři single guide RNA (sgRNA) hity byly upraveny ručně přidat BbsI omezení stránky a tyto sgRNA sekvence odsolený čistoty byly objednány od Invitrogen. Sekvence úspěšně použitá pro ATG9 CRISPR knockout byla:

Zvýrazněné nukleotidy označují přidáno převisy. SgRNA byla poté ligována v páteři psCas9-2A-puromycinu. Úspěšně ligované plazmidy nebo prázdná kontrola vektorů Cas9 byly poté transfektovány v buňkách HeLa a exprese byla povolena po dobu 24 hodin. Transfekované buňky byly poté vybrány přidáním puromycinu do buněk v konečné koncentraci 2-4 µg / ml. Buňky mohly růst, dokud nebyly všechny nepřenosné buňky mrtvé. Pozitivní buňky byly poté trypsinizovány a počet buněk byl hodnocen pomocí invitrogen Countess diapozitivů (10 µl homogenní buněčné suspenze +10 µl trypanové modři). Na základě populace živých buněk bylo 0,2 × 104 buněk nasáváno a sériově zředěno v 96jamkové destičce, aby se získaly kolonie jednotlivých buněk. Sériové ředění bylo vždy 1:1 a konečný objem v každé jamce na konci ředění byl udržován na 200 µl. Buněčné lyzáty byly poté načteny na stránku SDS, přeneseny na membránu, aby se zkontrolovalo knock-out ATG9.

kvantifikace dat a statistická analýza

obrázky byly kvantifikovány pomocí výchozího pluginu „analyzovat částice“ v ImageJ. Navíc, co-lokalizované pixelů byly identifikovány, a profil byl vygenerován pomocí bez dozoru ImageJ plugin algoritmus nazvaný ‚colocalization‘, který byl vyvinut Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Služba Imagerie, Paříž; 2003–2004). Western blot byly kvantifikovány pomocí LICOR Image Studio software (LICOR, USA) a hodnoty byly zpracovány, analyzovány a vykresleny pomocí programu Excel z Microsoft Office suite.

statistické hladiny významnosti pro srovnání mezi dvěma skupinami byly odhadnuty pomocí jednostranný nebo dvoustranný t-testy. Pro experiment zahrnující ATG7 a ATG10 KD byl k posouzení statistické významnosti údajů použit jednoocasý t-test. Pro všechny ostatní experimenty v této studii byl použit dvouocasý t-test k posouzení statistické významnosti dat. V této knize, hodnota p < 0.05 byla považována za statisticky významné a konvence použité pro znázornění výsledků v rámci tohoto článku jsou následující: *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0.001 a Chybové úsečky představují směrodatné odchylky, pokud není uvedeno jinak.