Calmodulin

Calmodulin-Wechselwirkungen mit Ca2+ und mit NOS

CaM ist ein kleines Ca2+ -bindendes Protein (Molekulargewicht 17 kDa), das aus zwei ähnlichen Kugellappen besteht, die durch eine zentrale Linkerregion verbunden sind. Jeder Lappen enthält zwei E-F-Hände, die eine N-terminale Helix (E-Helix), eine zentral gelegene Ca2 + -Koordinationsschleife und eine C-terminale Helix (F-Helix) umfassen (Domänen von CaM werden im Allgemeinen als 1-4 von N bis C bezeichnet) Terminal). Bei der Ca2 + -Bindung ist CaM in der Lage, an mehr als 30 Zielenzyme zu binden und diese zu aktivieren, wodurch es zahlreiche Second Messenger und Zellfunktionen regulieren kann. Die Bindung und vollständige Aktivierung von Zielproteinen durch CaM erfordert typischerweise die Belegung aller vier Ca2 + -Bindungsstellen in CaM. Der carboxyterminale Lappen enthält zwei hochaffine Ca2 + -Bindungsstellen, während der aminoterminale Lappen zwei Stellen mit niedrigerer Ca2 + -Affinität enthält. Konformationsänderungen treten in CaM auf, nachdem es Ca2 + bindet: hydrophobe Oberflächenreste werden freigelegt, um entscheidende Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit der hydrophoben Fläche der Zielpeptid-Erkennungsstelle zu bilden.

CaM bindet an jede NOS-Untereinheit in einer Stöchiometrie von 1:1 mit relativ hoher Affinität. Bindungsaffinitätsstudien mit Peptiden, die NOS-CaM-Erkennungssequenzen entsprechen, zeigen, dass die drei NOSs unterschiedliche Affinitäten gegenüber CaM aufweisen, wobei die allgemeine Ordnung zytokininduzierbare NOS (iNOS) ≫ neuronale NOS (nNOS) ≈ endotheliale NOS (eNOS) ist. Das iNOS-Peptid bindet gut an CaM sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Ca2 +, aber eNOS- und nNOS-Peptide binden nur in Gegenwart von Ca2 + an das CaM.

Jeder Lappen von CaM bindet unabhängig an NOS und zeigt unterschiedliche Affinitäten zu NOS. Die CAM-nNOS-Interaktion wurde mit CaM-Mutanten und pflanzlichen CaM-Proteinen untersucht. nNOS zeigt ein hohes Maß an struktureller Spezifität gegenüber CaM-Domänen 1, 3 und möglicherweise 4 in Bezug auf die Aktivierung der Häm-Reduktion und NO-Synthese. Die CaM-nNOS-Wechselwirkungen sind besonders wichtig für den Elektronentransfer und betreffen die Latch-Region von CaM (gebildet durch CaM-Domänen 1 und 3) und einen Methioninrest in Domäne 4. Diese Regionen von CaM scheinen mit noch unbekannten Regionen auf nNOS zu interagieren, die sich von ihrer kanonischen CaM-Bindungssequenz unterscheiden. Es wurde auch festgestellt, dass die Ladung und Länge des zentralen Linkers die Bindung und Aktivierung von iNOS durch elektrostatische Wechselwirkung im zentralen Linker und hydrophobe Wechselwirkungen in der globulären Domäne von CaM beeinflusst, was für seine enge Assoziation mit dem iNOS verantwortlich zu sein scheint. Die Ca2 + -Dissoziation von NOS-gebundenem CaM erfolgt in zwei aufeinanderfolgenden Schritten: Zuerst erfolgt eine schnelle Ca2 + -Dissoziation vom N-terminalen Lappen und entspricht der Inaktivierung der NO-Synthese, gefolgt von einer langsameren Ca2 + -Dissoziation vom C-terminalen Lappen, die zur Dissoziation von CaM von NOS führt. Konformationsänderungen treten in den NOS CaM-bindenden Peptiden auf, wenn sie CaM binden. Typischerweise erhalten die Peptide eine α-helikale Konformation bei Wechselwirkung mit Ca2 + gebundenem CaM. Eine CaM-induzierte Konformationsänderung in der NOS-Reduktase-Domäne tritt ebenfalls auf, wie durch Änderungen der Protein- und Flavinfluoreszenz und durch eine Änderung des Trypsin-Proteolysemusters angezeigt.

Eine kristallographische Struktur von Ca2 + -beladenem CaM, gebunden an ein 20-Rest-Peptid, das der ENOS-CaM-Erkennungssequenz entspricht, ist verfügbar. Die Struktur zeigte, dass das α-helikale eNOS-Peptid durch umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen antiparallel an CaM bindet: Die N-terminalen und C-terminalen Lappen von CaM wickeln sich um das gebundene Peptid und interagieren mit den C- und N-terminalen Hälften des Peptids. Spezifische CaM-Reste in der Latch-Region und Domäne 4 wurden in einer Weise positioniert, die mit ihrer Bedeutung übereinstimmt, wie durch Mutagenesestudien bestimmt. Die Kristallstruktur schlug auch eine Grundlage für eine engere CaM-Bindung in iNOS vor: da iNOS eine größere Anzahl hydrophober Rückstände innerhalb seiner entsprechenden Nockenerkennungssequenz enthält, wurde argumentiert, dass diese umfangreichere Van-der-Waals-Kontakte mit CaM unterstützen und die ungünstige Lösungsmittelexposition hydrophober Rückstände minimieren würden, um eine engere Zuordnung zwischen CaM und der iNOS-Nockenerkennungssequenz zu begünstigen.

Die Kristallstruktur eines Komplexes zwischen Ca2+/CaM und der FMN-Domäne menschlicher iNOS ist ebenfalls verfügbar. In der Struktur des Komplexes wurden vier verschiedene Konformationen identifiziert, was die flexible Natur von CaM– und FMN-Domänen-Domänen-Interaktionen demonstriert. Eine Salzbrücke, die zwischen CaM und der FMN-Domäne gebildet wird, ist in der Struktur offensichtlich und kann wichtig sein, um den Effekt der CaM-Bindung auf NOS-Funktionen zu übertragen.