Charakterisierung von Schleimhautlymphoidaggregaten bei Colitis ulcerosa: Immunzellphänotyp und TcR-γδ-Expression | Darm

Ergebnisse

LEUKOZYTEN BILDEN DEN HAUPTZELLTYP IM ENTZÜNDETEN UC-DICKDARM UND VERTEILEN SICH UNTERSCHIEDLICH IN DER DICKDARMSCHLEIMHAUT VON UC-PATIENTEN IM VERGLEICH ZU KONTROLLEN

Zwölf Proben des entzündeten Sigmas von UC-Patienten und 15 Proben des scheinbar normalen Sigmas von Patienten ohne IBD in der Anamnese wurden einer phänotypischen Analyse durch Immunhistochemie unterzogen. Neun dieser UC-Proben wurden als schwer krank eingestuft. Bei diesen war das Epithel abgeflacht mit einer reduzierten Anzahl von Becherzellen, verzweigten Krypten und gelegentlichen Ulzerationen. Krypta Abszesse waren häufig. Die Lamina propria enthielt zahlreiche verstreute Leukozyten sowie basale lymphoide Aggregate (Abb.1A). Drei UC-Proben wurden als mäßig krank eingestuft. Insgesamt war das Epithel intakt mit einer leicht reduzierten Anzahl von Becherzellen und keiner / wenigen verzweigten Krypten. Die Lamina propria enthielt eine erhöhte Anzahl von Leukozyten und lymphoide Aggregate waren vorhanden. Die morphometrische Analyse konzentrierte sich auf die Aggregate.

Die Aggregate bestanden aus knotenförmig zusammenlaufenden Clustern von Lymphozyten ohne typische reaktive Zentren. Sie befanden sich zwischen den Kryptenbasen und der Submukosa ohne erkennbaren Kontakt mit dem Luminalepithel (Abbildung 1A). Es wurde jedoch häufig eine enge Nähe zwischen Zellen in den Aggregaten und dem Kryptenepithel festgestellt (Abb.1A, D). Die Häufigkeit der Aggregate (Anzahl / Fläche) war bei mäßig und stark erkranktem Gewebe ähnlich und reichte von 1,3 bis 4,9 Aggregaten pro mm2 Lamina propria (Tabelle 3). Die von den Aggregaten eingenommene Fläche der Lamina propria nahm jedoch mit der Schwere der Erkrankung zu und machte bei einigen Patienten bis zu 45% der Lamina propria im stark erkrankten Dickdarm aus (Tabelle 3). Normale solitäre Follikel im Kontrollkolon waren selten (weniger als 0,1 Follikel / mm2 Lamina propria, n = 8).

Ungefähr 75% der Zellen in den Aggregaten waren Leukozyten (74 (7)% CD45 + -Zellen (n = 9)). Der Anteil an Leukozyten in solitären Lymphfollikeln war ebenfalls hoch (67 (6)% CD45 + -Zellen (n= 8)). Beide Werte können unterschätzt werden, da die Färbung mit Anti-CD45-mAb heterogen war. Diese heterogene Färbung kann zumindest teilweise durch eine verminderte Expression von CD45 auf aktivierten B-Zellen erklärt werden.

Die Anzahl der Leukozyten sowohl in der Lamina propria außerhalb der Aggregate (26 (7)% CD45 + -Zellen (n=4)) als auch in der Submukosa (8 (2)% CD45 + -Zellen (n= 4)) war im Dickdarm im Vergleich zum normalen Dickdarm erhöht (15 (2)% CD45 + -Zellen in der Lamina propria außerhalb der Follikel und 4 (2)% CD45 + -Zellen in der Submukosa (n = 4)).

Intraepitheliale Leukozyten waren im UC-Dickdarm im Vergleich zum normalen Dickdarm in niedrigeren Häufigkeiten vorhanden: 28 (7) CD45+ -Zellen/1000 Epithelzellen in schwer erkranktem Dickdarmgewebe (n= 4) verglichen mit 66 (26) CD45 + -Zellen/1000 Epithelzellen in Kontrollen (n = 4, p= 0,03). IEL wurden hauptsächlich im distalen Epithel im Dickdarm nachgewiesen, teilweise aufgrund von Erosionen des luminalen Oberflächenepithels. Im normalen Dickdarm befanden sich > 60% der IEL im luminalen Epithel. Da die Dichte des IEL im Kryptal niedriger ist als im Luminalepithel im normalen Dickdarm, kann die geringere Häufigkeit des IEL im UC-Dickdarm durch die Tatsache erklärt werden, dass der UC-Dickdarm hauptsächlich Kryptalepithel enthält.

AGGREGATE IM DICKDARMGEWEBE VON UC-PATIENTEN UMFASSEN FAST AUSSCHLIEßLICH T- UND B-LYMPHOZYTEN

Aggregate wurden auf das Vorhandensein der drei Haupttypen von Lymphozyten analysiert: T-Zellen (Anti-CD3-MAK), B-Zellen (eine Mischung aus Anti-CD19-, Anti-CD20- und Anti-CD22-MAK) und NK-Zellen. Für die Analyse von NK-Zellen wurde Anti-CD57-mAb ausgewählt, da wir zuvor gezeigt haben, dass αβ- und γδ-T-Zellen, die den klassischen NK-Zellmarker CD56 exprimieren, im menschlichen Darm vorhanden sind.25 Anti-CD15 wurde zum Nachweis von Granulozyten, Anti-CD14 für Blutmonozyten / kürzlich rekrutierte Makrophagen und Anti-CD68 für Gewebemakrophagen verwendet. Zum Nachweis follikulärer dendritischer Zellen (FDC) wurden drei verschiedene mAbs verwendet (Tabelle 2). Anti-CD80/B7.1 wurde zum Nachweis von Zellen mit Antigen-Präsentier-funktion und Anti-CD1a als zusätzlicher Marker für dendritische/Langerhans-Zellen verwendet. Die Ergebnisse der immunomorphometrischen Analyse sind in Abbildung 3 zusammengefasst. Die beiden Hauptzelltypen waren T- und B-Zellen und die Summe aus CD3 + -Zellen und CD19/20/22+ zellen entsprach die Anzahl der CD45+ Zellen in den meisten Proben (77 (12)% im Vergleich zu 74 (7)% CD45+ Zellen (n=9)). T- und B-Zellen bildeten gleich große Anteile der Zellen in den Aggregaten. Die Aggregate enthielten große T-Zellbereiche ohne B-Zellen und reziproke Bereiche, die von B-Zellen mit nur wenigen verstreuten T-Zellen dominiert wurden (Abbildung 2A, B). Die meisten Aggregate bestanden aus dicht gepackten Zellen, aber in einigen Fällen wurden begrenzte Bereiche lockerer gepackter Zellen in der B-Zell-Zone nachgewiesen. Der Anteil an B-Zellen war in Aggregaten von schwer erkranktem UC-Dickdarm signifikant höher als in mäßig erkranktem Gewebe (43 (8) v 30 (6); p = 0,03), was auf eine erhöhte Bedeutung von B-Zellen bei schweren Formen der Erkrankung hindeutet. Solitäre Follikel im normalen Dickdarm hatten ein etwas anderes Aussehen. Das Zentrum des Follikels enthielt lose gepackte große B-Zellen mit wenigen, wenn überhaupt T-Zellen, umgeben von einer Zone von B- und T-Zellen und Bereichen in der Peripherie, die nur T-Zellen enthielten (Abbildung 2D, E).

Follikuläre dendritische Zellen wurden in sieben von neun UC-Proben mit drei verschiedenen Anti-FDC-mAbs nachgewiesen. Es wurde kein Unterschied in den Färbemustern zwischen den drei mAbs beobachtet. Die positiv gefärbten follikulären dendritischen Zellen bildeten ein Netzwerk, das sich im B-Zellbereich der Aggregate befand (Abbildung 2B, C). Obwohl jedes Aggregat mindestens einen B-Zell-Bereich enthielt, enthielten nur etwa 40% ein FDC-Netzwerk. FDC-Netzwerke wurden in T-Zell-Gebieten nie gesehen. Im normalen Dickdarm enthielt jeder Follikel ein FDC-Netzwerk, das auf den B-Zellbereich beschränkt war (Abbildung 2E, F). CD80/B7.1+ dendritische Zellen waren auch in den Aggregaten des Dickdarms vorhanden. Sie wurden am häufigsten als einzelne dendritische Zellen gesehen, die von kleinen CD80 + -Punkten zwischen Lymphozyten umgeben waren, vermutlich Querschnitte dendritischer Vorsprünge. Gelegentlich war ein vollständiges Netzwerk von CD80+ -Zellen zu sehen (Abb.1E). Dieses Netzwerk befand sich in einem T-Zell-Bereich. In den Aggregaten wurden keine CD1a+-Zellen mit dendritischer Morphologie nachgewiesen.

Obwohl der Anteil an Granulozyten, CD15+ -Zellen, in den meisten UC-Proben erhöht war, befanden sich solche Zellen im Allgemeinen außerhalb der Aggregate (Abb. 3). Zahlreiche Gewebemakrophagen, CD68 + -Zellen, waren in der Lamina propria außerhalb der Aggregate vorhanden. In den Aggregaten waren sie knapp und befanden sich im äußeren Rand (Abb. 3). Im normalen Dickdarm waren die meisten CD68+ -Zellen in der Nähe des luminalen Epithels lokalisiert.29 Aggregate mit einer signifikanten Anzahl von CD14 + -Zellen wurden in nur zwei Proben gesehen. Diese Proben hatten auch eine hohe Häufigkeit von CD14 + -Zellen in der Submukosa (dh ≈ 3,5% CD14 + -Zellen im Vergleich zu ≈1% CD14 + -Zellen in anderen UC-Kolonproben und Kontrollkolon). Darüber hinaus waren CD14 + -Zellen in der Nähe von Blutgefäßen konzentriert, was auf eine anhaltende Invasion von Monozyten hindeutet. Es gab keinen offensichtlichen klinischen Parameter, der erklären könnte, warum eine Monozyteninvasion aufgetreten war, insbesondere in diesen beiden Proben. NK-Zellen, CD57 + -Zellen, waren sowohl in UC als auch in normalem Dickdarmgewebe selten und wurden nur gelegentlich in Aggregaten nachgewiesen (Abb.3).

Die lymphoiden Aggregate im UC-Dickdarm unterschieden sich nicht signifikant von solitären Follikeln im normalen Dickdarm in Bezug auf die Anzahl der T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen / Monozyten, Granulozyten und NK-Zellen (Abb. 3). Darüber hinaus wurde in beiden Arten von Strukturen ein FDC-Netzwerk in der B-Zell-Zone beobachtet. Den Aggregaten fehlte jedoch eine typische keimzentrumsähnliche B-Zellzone mit lose gepackten B-Zellen, die in normalen solitären Follikeln zu sehen ist. Darüber hinaus besetzten die Aggregate im Dickdarm bis zu 45% der Lamina propria.

AGGREGATE IM DICKDARM WERDEN VON γδ-T-ZELLEN BESIEDELT

Überraschend viele Zellen in den Aggregaten waren γδ-T-Zellen (11 (7%) TcR-γδ+-Zellen (n=9)) (Abb.1B,3). Im Gegensatz dazu wurden in Follikeln des normalen Dickdarms fast keine γδ-T-Zellen nachgewiesen (0,3 (0.3)% TcR-γδ+ Zellen (n=8) (p<0,001)) (Abb.3). Die Anzahl der TcR-γδ + -Zellen in den Aggregaten nahm mit der Schwere der Erkrankung zu. Das Verhältnis von TcR-αβ + -Zellen zu TcR-γδ + -Zellen in den Aggregaten betrug 2,4 (0,9) in stark erkrankten UC-Proben (n = 6), variierte jedoch von 1,3 bis 42 in mäßig erkrankten Proben (n = 3) und war > 300 in normalen Kolonfollikeln. In fünf Proben wurden die Häufigkeiten von γδ-T-Zellen sowohl in Aggregaten als auch in lamina propria außerhalb der Aggregate bestimmt. In den Aggregaten betrug die Häufigkeit von TcR-γδ+-Zellen 3,9 (2.5) mal höher als außerhalb der Aggregate. TcR-γδ+ -Zellen in den Aggregaten exprimierten hauptsächlich Vδ1, während die meisten Zellen, die Vδ2 verwendeten, außerhalb der Aggregate gefunden wurden. Die gesamte LPL-Fraktion wurde auf Vδ-Gennutzung durch Immunflußzytometrie an isolierten Zellen analysiert. In Übereinstimmung mit den immunhistochemischen Ergebnissen exprimierten 86 (10)% der TcR-γδ+-Zellen Vδ1, während die übrigen Zellen Vδ2 exprimierten (Tabelle 4). In Übereinstimmung mit der ultrastrukturellen Analyse von γδ + T-Zellen (siehe unten) zeigte die Färbung von TcR-γδ + -Zellen in der Immunhistochemie häufig ein fleckiges oder fleckiges Erscheinungsbild (Abb. 1B, Inset) und zeigte eine relativ geringe Fluoreszenzintensität in der Immunflußzytometrie (Abb. 4). Aufgrund des heterogenen Färbemusters für TcR-γδ kann die Anzahl der γδ+ T-Zellen unterschätzt werden. Die zweifarbige Immunflusszytometrie-Analyse isolierter LPL zeigte, dass fast alle γδ+ T-Zellen CD45R0 exprimierten. Bis zu 15% der γδ + T-Zellen exprimierten CD8, aber die meisten γδ + T-Zellen waren doppelt CD4 / CD8-negativ.

CD4 +CD28-αβ T-ZELLEN BILDEN DEN HAUPT-T-ZELL-SUBTYP IN DEN AGGREGATEN

Die Mehrheit der T-Zellen in den Aggregaten exprimierte TcR-αβ und der Anteil der CD4 + -Zellen war höher als der Anteil der CD8 + -Zellen (Abb.3) mit einem durchschnittlichen CD4 / CD8-Verhältnis von 1,7 (0.7) (n=8). Die Dominanz von CD4 + -Zellen war noch ausgeprägter, wenn isolierte LPL analysiert wurden (Abbildung 4). Die zweifarbige Immunflusszytometrie-Analyse von LPL zeigte, dass fast alle CD4 + -Zellen TcR-αβ exprimierten (Daten nicht gezeigt). CD8+ -Zellen wurden nur im T-Zell-Bereich der Aggregate gefunden, während CD4+ -Zellen sowohl im T-Zell-Bereich als auch verstreut im B-Zell-Bereich vorhanden waren. In mehreren Proben überstieg die Summe der CD4+- und CD8+-Zellen die Anzahl der CD3+-Zellen und/oder TcR+-Zellen. Dies spiegelt wahrscheinlich eine Unterschätzung der T-Zellen aufgrund der geringen Expression des CD3 / TcR-Komplexes und nicht der Anwesenheit von doppelt positiven CD4 / CD8-Zellen wider, da nur 2,4 (1,3)% (n = 4) der gesamten LPL in der Immunflusszytometrieanalyse doppelt positiv waren (Abb. 4). Obwohl zahlreiche Zellen, die den T-Zell-Co-Rezeptor CD28 exprimieren, außerhalb der Aggregate in lamina propria verstreut waren (13 (2)% CD28 + -Zellen (n= 3)), wurden in den Aggregaten keine CD28+ -Zellen nachgewiesen (Tabelle 5; Abbildung 1D).

Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Häufigkeiten und Phänotypen von αβ-T-Zell-Untergruppen zwischen Aggregaten im UC-Kolon und solitären Follikeln im Kontrollkolon (Abb. 3).

DIE MEISTEN B-ZELLEN IN DEN AGGREGATEN EXPRIMIEREN IgM AUF IHRER OBERFLÄCHE

Die Mehrheit der Zellen im B-Zellbereich von Aggregaten zeigte eine Färbung durch Anti-IgM-mAk (42 (5)% IgM + -Zellen (n = 4)) entsprechend 95 (7)% der CD19/20/22+ zellen. Es wurden jedoch nicht weniger als 19 (2)% der Zellen in den Aggregaten exprimiert IgA und eine kleine Fraktion von IgG + -Zellen (3,3 (0,4)% (n = 4)) wurden ebenfalls nachgewiesen. Diese Daten deuten darauf hin, dass B-Zellen in den Aggregaten mehr als einen Immunglobulin-Isotyp exprimieren und möglicherweise kürzlich einen Klassenwechsel erfahren haben. Keine Ig + -Zellen zeigten eine zytoplasmatische Färbung, was darauf hindeutet, dass Plasmazellen in den Aggregaten nicht vorhanden waren. Im Gegensatz dazu wurden Plasmazellen außerhalb der Aggregate gefunden.

IgM + -Zellen (28 (2)% (n = 4)) zahlenmäßig unterlegen IgA + -Zellen (14 (1)% (n = 4)) und IgG + -Zellen (2,2 (0,4)% (n = 4)) in den Follikeln des Kontrollkolons. Die Summe der Ig + -Zellen entsprach jedoch der Anzahl der CD19/20/22+ zellen in einzelnen Proben. Interessanterweise war, obwohl es keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der B-Zellen in Follikeln im Vergleich zu Aggregaten gab (Abb. 3), der Anteil an Oberflächen-IgM + -Zellen, Oberflächen-IgA + -Zellen und Oberflächen-IgG + -Zellen signifikant höher in Aggregaten von UC Colon als in Follikeln von Kontrollkolon (p < 0,01 für alle drei Isotypen).

EXPRESSION VON NICHT EINGESCHRÄNKTEN SUBTYP-MARKERN IN LYMPHOIDEN AGGREGATEN DES DICKDARMS

Ungefähr 50% der Zellen in den lymphoiden Aggregaten exprimierten den Speicher- / Aktivierungsmarker CD45R0 (Tabelle 5). Darüber hinaus zeigte die Analyse isolierter LPL, dass CD45R0- und CD45RA-exprimierende Zellen jeweils etwa 50% der Population ausmachten (n = 4). Die Mehrheit der CD3+ -Zellen exprimierte CD45R0, aber ein signifikanter Anteil der CD45RA-exprimierenden CD3 + -Zellen war ebenfalls vorhanden (Abbildung 4). Die Mehrheit der CD45R0-exprimierenden Zellen waren T-Zellen und 20-40% der CD45R0 + -Zellen waren B-Zellen. In zwei Proben überschritt die Summe der CD45R0- und CD45RA-exprimierenden Zellen 100%, was darauf hindeutet, dass Zellen, die beide Spleißvarianten exprimieren, gleichzeitig vorhanden sein können.

Die Mehrheit der MHC-Klasse-II-exprimierenden Zellen befand sich im B-Zell-Bereich, aber verstreute MHC-Klasse-II-positive Zellen wurden im T-Zell-Bereich gesehen (Daten nicht gezeigt). Der Anteil der HLA-DR exprimierenden Zellen betrug ca.50% (Tabelle 5). In fünf Proben übertraf die Anzahl der HLA-DR + -Zellen die Anzahl der B-Zellen, was darauf hindeutet, dass einige T-Zellen in den Aggregaten (31-89% der CD3 + -Zellen in diesen Einzelproben) auch HLA-DR exprimieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit drei Proben erhalten, die auf HLA-DQ-Expression analysiert wurden (Tabelle 5).

Interessanterweise wurde das Integrin aEß7, das auf einer großen Anzahl von IEL im normalen Darm vorhanden ist, auf 26 (13)% der Zellen in den Aggregaten exprimiert (Abbildung 1C, Tabelle 5). Positive Zellen zeigten eine heterogene Verteilung, mit einigen Bereichen mit vielen positiven Zellen und anderen Bereichen mit wenigen positiven Zellen. Die aeexprimierenden Zellen zeigten Variation in der Intensität der Färbung (fig1C).

Ein Drittel der Lymphozyten in den Aggregaten exprimierte das antiapoptotische Protein bcl-2 (Abb.1F, Tabelle 5). Bcl-2 exprimierende Zellen wurden über das gesamte Aggregat verstreut. In normalen solitären Follikeln wurden etwa 10% der bcl-2-positiven Zellen gesehen. Sie befanden sich alle in der B-Zell-Zone.

ULTRASTRUKTURANALYSEN VON γδ-T-ZELLEN IM UC-COLON ZEIGEN INTERNALISIERUNG UND OBERFLÄCHEN-DOWNREGULATION VON TcR-γδ

Die immunelektronenmikroskopische Untersuchung konzentrierte sich auf γδ-T-Zellen im UC-Colon. Zu Vergleichszwecken analysierten wir auch γδ-T-Zellen in normaler Dickdarmschleimhaut. TcR-γδ wurde als Ablagerungen des elektronendichten Reaktionsproduktes nachgewiesen.

Im Normalkolon war das Reaktionsprodukt homogen auf der Zelloberfläche aller gefundenen γδ-T-Zellen verteilt, sowohl auf denen in der Lamina propria (Figur 5A) als auch auf den intraepithelialen γδ-T-Zellen (Figur 5B).

Im Gegensatz dazu zeigten γδ-T-Zellen im Dickdarm eine extreme Variabilität in der Verteilung des Reaktionsprodukts von der Zelloberfläche zum Zytoplasma. Wir identifizierten fünf Arten von Färbemustern (fünf Morphotypen). γδ-T-Zellen des ersten Typs (Figur 6A) zeigten eine heterogene Verteilung des Reaktionsproduktes auf der Zelloberfläche. Einige zeigten einzelne positiv gefärbte multivesikuläre Körper. In γδ-T-Zellen des zweiten Typs wurde das Reaktionsprodukt als knappe lineare Cluster gesehen, die mehr oder weniger zufällig über die Zelloberfläche verteilt waren (Figur 6B). Darüber hinaus wurden einige Clusterablagerungen über und innerhalb von Oberflächeninvasionen lokalisiert, die von flachen Gruben bis zu tieferen kolbenförmigen Invaginationen variierten (Abbildung 6B, Ausschnitt). Es war nicht möglich, zusätzliche Gegenfärbungen zu verwenden. Obwohl einige der oberflächlichen Invaginationen beschichteten Gruben ähnelten, konnten wir nicht feststellen, ob diese Invaginationen beschichtet waren oder nicht. In γδ-T-Zellen des dritten Typs befand sich das Reaktionsprodukt als Zelloberflächencluster sowie in zytoplasmatischen Vakuolen mit morphologischen Eigenschaften von Endosomen (Figur 6C). In γδ-T-Zellen des vierten Typs war das Reaktionsprodukt reichlich im Zytoplasma vorhanden, aber auf der Zelloberfläche kaum nachweisbar (Figur 6D, E, F). Das Reaktionsprodukt färbte zahlreiche zytoplasmatische Vesikel und Vakuolen nahe der Zellmembran und auch tief in den zellkernnahen Zellen. Positiv gefärbte Vesikel wurden manchmal in Kontinuität mit der Plasmamembran gesehen und ähnelten beschichteten Vesikeln (Abbildung 6E). Zahlreiche multivesikuläre Körper, die aus dicht gepackten Mikrovesikeln bestanden, wurden ebenfalls angefärbt (Abbildung 6F). γδ-T-Zellen des fünften Typs waren selten (Abb.6G, H). Dieser Morphotyp zeigte gewöhnlich eine starke positive Färbung der Plasmamembran und des perinukleären Raums. Manchmal färbt das Reaktionsprodukt verschiedene zytoplasmatische Vakuolen unterschiedlicher Größe und Form. Es wurde kein offensichtlicher Unterschied zwischen den einzelnen untersuchten UC-Dickdarmproben festgestellt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mehrheit der γδ-T-Zellen (Morphotypen 1-4) im Dickdarm eine zelluläre Lokalisation des Reaktionsprodukts aufwies, die höchstwahrscheinlich die verschiedenen aufeinanderfolgenden Schritte der TcR-Internalisierung widerspiegelte: Bildung von Clustern, beschichteten Gruben, beschichteten Vesikeln, Endosomen und multivesikulären Körpern.30 Eine kleine Anzahl von Zellen (Morphotyp 5) zeigte eine aktive Synthese von TcR-γδ-Molekülen.