Caracterización de los agregados linfoides de la mucosa en la colitis ulcerosa: fenotipo de células inmunitarias y expresión de TcR-γδ | Intestino

Resultados

LOS leucocitos CONSTITUYEN EL TIPO de CÉLULA PRINCIPAL EN EL COLON CON CUCI INFLAMADA Y SE DISTRIBUYEN DE MANERA DIFERENTE EN LA MUCOSA COLÓNICA DE LOS PACIENTES CON CUCI EN COMPARACIÓN CON LOS CONTROLES

Doce muestras de colon sigmoide inflamado de los pacientes con CUCI y 15 muestras de colon sigmoide aparentemente normal de los pacientes con los antecedentes de EII se sometieron al análisis fenotípico por inmunohistoquímica. Nueve de estas muestras de CUCI fueron clasificadas como gravemente enfermas. En estos, el epitelio se aplanó con un número reducido de células cálices, criptas ramificadas y ulceraciones ocasionales. Los abscesos en criptas eran comunes. La lámina propia contenía numerosos leucocitos dispersos, así como agregados linfoides basales (fig.1A). Tres muestras de CU se clasificaron como moderadamente enfermas. En todo el epitelio estaba intacto, con un número ligeramente reducido de células cálices y sin criptas ramificadas o pocas. La lámina propia contenía un mayor número de leucocitos y agregados linfoides presentes. El análisis morfométrico se centró en los agregados.

Los agregados comprendían grupos de linfocitos fusionados nodulares sin centros reactivos típicos. Se ubicaron entre las bases de las criptas y la submucosa sin contacto aparente con el epitelio luminal (fig. 1A). Sin embargo, a menudo se observó una estrecha proximidad entre las células de los agregados y el epitelio de la cripta (fig.1A, D). La frecuencia de agregados (número/área) fue similar en tejidos con enfermedades moderadas y graves, variando de 1,3 a 4,9 agregados por mm2 de lámina propia (tabla 3). Sin embargo, el área de la lámina propia ocupada por los agregados aumentó con la gravedad de la enfermedad y constituyó hasta el 45% de la lámina propia en el colon gravemente enfermo de algunos pacientes (tabla 3). Los folículos solitarios normales en el colon control fueron infrecuentes (menos de 0,1 folículo/mm2 de lámina propia, n=8).

Aproximadamente el 75% de las células de los agregados eran leucocitos (74 (7) % de células CD45+ (n = 9)). La proporción de leucocitos en folículos linfoides solitarios también fue alta (67 (6) % de células CD45+(n=8)). Ambos valores pueden estar subestimados, ya que la tinción con aBm anti-CD45 fue heterogénea. Esta tinción heterogénea puede explicarse, al menos en parte, por la disminución de la expresión de CD45 en las células B activadas.

El número de leucocitos tanto en la lámina propia fuera de los agregados (26 (7)% de células CD45+ (n=4)) como en la submucosa (8 (2)% de células CD45+ (n=4)) aumentó en el colon con CUCI en comparación con el colon normal (15 (2)% de células CD45+ en la lámina propia fuera de los folículos y 4 (2)% de células CD45+en la submucosa (n=4)).

Los leucocitos intraepiteliales estaban presentes en frecuencias más bajas en el colon CUCI comparado con el colon normal: 28 (7) células CD45+/1000 células epiteliales en tejido colónico gravemente enfermo (n=4) en comparación con 66 (26) células CD45+/1000 células epiteliales en controles (n=4, p=0,03). Los LIE se detectaron principalmente dentro del epitelio criptal en el colon de la UC, en parte debido a erosiones del epitelio de la superficie luminal. En el colon normal, > 60% del LEI se localizó en el epitelio luminal. Por lo tanto, como la densidad de LEI es menor en el epitelio cripto que en el epitelio luminal en el colon normal, la menor frecuencia de LEI en el colon CUC puede explicarse por el hecho de que el colon CUC contiene principalmente epitelio cripto.

LOS AGREGADOS EN EL TEJIDO COLÓNICO DE PACIENTES CON CUCI COMPRENDEN CASI EXCLUSIVAMENTE LINFOCITOS T Y B

Se analizaron los agregados para determinar la presencia de los tres tipos principales de linfocitos: células T (mAb anti-CD3), células B (una mezcla de MAB anti-CD19, anti-CD20 y anti-CD22) y células NK. Para el análisis de células NK, se eligió mAb anti-CD57, ya que hemos demostrado previamente que las células T αβ y γδ que expresan el marcador clásico de células NK CD56 están presentes en el intestino humano.25 Se utilizó Anti-CD15 para detectar granulocitos, anti-CD14 para monocitos sanguíneos / macrófagos reclutados recientemente, y anti-CD68 para macrófagos tisulares. Para detectar células dendríticas foliculares (CDF) se utilizaron tres mAbs diferentes (tabla 2). Se utilizó Anti-CD80/B7.1 para detectar células con función presentadora de antígenos y anti-CD1a como marcador adicional para células dendríticas/de Langerhans. Los resultados del análisis inmunomorfométrico se resumen en la figura 3. Los dos tipos principales de células fueron las células T y B y la suma de células CD3+ y CD19/20/22+las células igualaron el número de células CD45+ en la mayoría de las muestras (77 (12)% en comparación con 74 (7)% de células CD45+ (n=9)). Las células T y B constituían proporciones igualmente grandes de las células de los agregados. Los agregados contenían grandes áreas de células T sin células B y áreas recíprocas dominadas por células B con solo unas pocas células T dispersas (fig.2A, B). La mayoría de los agregados consistían en células densamente empaquetadas, pero en algunos casos se detectaron áreas limitadas de células más empaquetadas en la zona de células B. La proporción de células B fue significativamente mayor en agregados de colon con CUCI gravemente enfermo en comparación con tejido moderadamente enfermo (43 (8)v 30 (6); p=0,03), lo que sugiere una mayor importancia de las células B en formas graves de la enfermedad. Los folículos solitarios en el colon normal tenían un aspecto ligeramente diferente. El centro del folículo contenía células B grandes poco empaquetadas con pocas células T, o ninguna, rodeadas por una zona de células B y T y áreas periféricas que contenían solo células T (fig.2D, E).

Se detectaron células dendríticas foliculares en siete de nueve muestras de CUC utilizando tres mAbs anti-FDC diferentes. No se observaron diferencias en los patrones de tinción entre los tres mAbs. Las células dendríticas foliculares teñidas positivamente formaron una red que se ubicó en el área de células B de los agregados (fig.2B, C). Aunque cada agregado contenía al menos un área de celdas B, solo alrededor del 40% contenía una red FDC. Las redes de CDF nunca se vieron en áreas de células T. En el colon normal, cada folículo contenía una red de CDF que estaba confinada al área de células B (fig.2E, F). CD80 / B7.las células dendríticas 1 + también estaban presentes en los agregados del colon de la CUCI. Se veían con mayor frecuencia como células dendríticas individuales rodeadas de pequeños puntos CD80+ entre linfocitos, presumiblemente secciones transversales de protuberancias dendríticas. Ocasionalmente se podía ver una red completa de células CD80+ (fig.1E). Esta red estaba ubicada en un área de células T. No se detectaron células CD1a+ con morfología dendrítica en los agregados.

Aunque la proporción de granulocitos, células CD15+, fue elevada en la mayoría de las muestras de CUCI, dichas células se ubicaron generalmente fuera de los agregados (fig.3). Numerosos macrófagos tisulares, células CD68+, estaban presentes en la lámina propia fuera de los agregados. En los agregados eran escasos y se ubicaban en el borde exterior (fig. 3). En el colon normal, la mayoría de las células CD68 + se localizaron en la proximidad del epitelio luminal.Se observaron 29 agregados con un número significativo de células CD14+ en solo dos muestras. Estas muestras también tenían una alta frecuencia de células CD14 + en la submucosa(es decir, ≈3,5% de células CD14 + en comparación con ≈1% de células CD14 + en otras muestras de colon con CUCI y colon de control). Además, las células CD14 + se concentraron cerca de los vasos sanguíneos, lo que sugiere una invasión continua de monocitos. No había ningún parámetro clínico obvio que pudiera explicar por qué se había producido la invasión de monocitos, particularmente en estas dos muestras. Las células NK, células CD57+, fueron raras tanto en CUCI como en tejido de colon normal y solo se detectaron ocasionalmente en agregados (fig3).

Los agregados linfoides en el colon CUCI no difieren significativamente de los folículos solitarios en el colon normal con respecto al número de células T, células B, macrófagos/monocitos, granulocitos y células NK (fig.3). Además, se observó una red FDC ubicada en la zona de células B en ambos tipos de estructuras. Sin embargo, los agregados carecían de una zona típica de células B en forma de centro germinal con células B poco empaquetadas que se ve en folículos solitarios normales. Además, los agregados en el colon CUCI ocuparon hasta el 45% de la lámina propia.

LOS AGREGADOS EN EL COLON UC SON COLONIZADOS POR CÉLULAS T γδ

Un número sorprendentemente grande de las células en los agregados eran células T γδ (11 (7%) células TCR-γδ+ (n=9)) (fig.1B,3). En contraste, casi no se detectaron células T γδ en los folículos del colon normal (0,3 (0.3) % de células TCR-γδ +(n = 8) (p<0,001)) (fig.3). El número de células TCR-γδ+ en los agregados aumentó con la gravedad de la enfermedad. La relación de células TCR-αβ+ a células TcR-γδ+ en los agregados fue de 2,4 (0,9) en muestras de CUCI gravemente enfermas (n=6), pero varió de 1,3 a 42 en muestras moderadamente enfermas (n=3) y fue >300 en folículos normales de colon. En cinco muestras se determinaron las frecuencias de células T γδ tanto en agregados como en lámina propia fuera de los agregados. En los agregados, la frecuencia de las células TCR-γδ+ fue de 3,9 (2.5) veces más alto que fuera de los agregados. Las células TCR-γδ+ en los agregados expresaron principalmente Vδ1, mientras que la mayoría de las células que usaban Vδ2 se encontraron fuera de los agregados. La fracción total de LPL se analizó para el uso del gen Vδ mediante citometría inmunoflow en células aisladas. De acuerdo con los resultados inmunohistoquímicos, el 86 (10)% de las células TCR-γδ+expresaron Vδ1, mientras que las células restantes expresaron Vδ2 (tabla 4). En línea con el análisis ultraestructural de las células T γδ+ (ver más abajo), la tinción de las células TCR-γδ+a menudo mostró un aspecto irregular o manchado en inmunohistoquímica (figura 1B, recuadro) y mostró una intensidad de fluorescencia relativamente baja en la citometría inmunoflow (figura 4). Debido al patrón de tinción heterogéneo de TcR-γδ, el número de células T γδ+ puede estar subestimado. El análisis de citometría inmunoflow de dos colores de LPL aislada mostró que casi todas las células T γδ + expresaban CD45R0. Hasta el 15% de las células T γδ+ expresaban CD8, pero la mayoría de las células T γδ+ eran CD4/CD8 doble negativo.

LAS CÉLULAS T CD4+CD28−αβ CONSTITUYEN EL SUBTIPO PRINCIPAL DE CÉLULAS T EN LOS AGREGADOS

La mayoría de las células T en los agregados expresaron TCR-αβ y la proporción de células CD4+ fue mayor que la proporción de células CD8+ (figura 3) con una relación CD4/CD8 media de 1,7 (0).7) (n = 8). La dominancia de las células CD4+ fue aún más pronunciada cuando se analizaron LPL aisladas (fig.4). El análisis de citometría inmunoflow de dos colores de LPL mostró que casi todas las células CD4 + expresaban TcR-αβ (datos no mostrados). Las células CD8 + se encontraron solo en el área de células T de los agregados, mientras que las células CD4+ estaban presentes tanto en el área de células T como dispersas en el área de células B. En varias muestras, la suma de células CD4+ y CD8+ superó el número de células CD3+ y/o células TcR+. Esto probablemente refleja la subestimación de las células T debido a la expresión de bajo nivel del complejo CD3/TcR en lugar de la presencia de células CD4/CD8 con doble positivo, ya que solo el 2,4 (1,3)% (n=4) del LPL total fue doble positivo en el análisis de citometría inmunoflow (fig.4). Aunque numerosas células que expresaban el co-receptor de células T CD28 se dispersaron en lámina propia fuera de los agregados (13 (2)% de células CD28+ (n=3)), no se detectaron células CD28+ en los agregados (tabla 5; fig.1D).

No hubo diferencias significativas en las frecuencias y fenotipos de los subconjuntos de células T αβ entre los agregados en el colon CU y los folículos solitarios en el colon control (fig.3).

LA MAYORÍA DE LAS CÉLULAS B DE LOS AGREGADOS EXPRESAN IgM EN SU SUPERFICIE

La mayoría de las células en el área de células B de los agregados mostraron tinción por anti-IgM mAb (42 (5) % de células IgM + (n = 4)) correspondiente al 95 (7)% del CD19/20/22+ células. Sin embargo, no menos del 19 (2)% de las células de los agregados expresaban IgA y también se detectó una pequeña fracción de células IgG+ (3,3 (0,4)% (n=4)). Estos datos sugieren que las células B en los agregados expresan más de un isotipo de inmunoglobulina y pueden haber sido sometidas recientemente a un cambio de clase. Ninguna célula Ig + mostró tinción citoplasmática, lo que indica que las células plasmáticas no estaban presentes en los agregados. Por el contrario, se encontraron células plasmáticas fuera de los agregados.

Células IgM +(28 (2)% (n=4)) superaron en número a células IgA+(14 (1)% (n=4)) y células IgG+ (2,2 (0,4)% (n=4)) en los folículos del colon de control. Sin embargo, la suma de células Ig + equivalía al número de CD19/20/22+ células en muestras individuales. Más interesante, aunque no hubo diferencia significativa en el número de células B en los folículos en comparación con los agregados (figura 3), la proporción de células IgM+de superficie, células IgA+ de superficie e células IgG+de superficie fue significativamente mayor en los agregados de colon CU que en los folículos del colon control (p<0,01 para los tres isotipos).

EXPRESIÓN DE MARCADORES NO RESTRINGIDOS DEL SUBTIPO EN AGREGADOS LINFOIDES DE COLON CUCI

Aproximadamente el 50% de las células de los agregados linfoides expresaron el marcador de memoria/activación CD45R0 (tabla 5). Además, el análisis de LPL aislada mostró que las células que expresaban CD45R0 y CD45RA constituían aproximadamente el 50% de la población (n=4). La mayoría de las células CD3+ expresaban CD45R0, pero también estaba presente una fracción significativa de las células CD45RA que expresaban CD3 + (fig.4). La mayoría de las células que expresaban CD45R0 eran células T y el 20-40% de las células CD45R0+ eran células B. En dos muestras, la suma de células de expresión CD45R0 y CD45RA superó el 100%, lo que sugiere que las células que expresan ambas variantes de empalme pueden estar presentes simultáneamente.

La mayoría de las células de expresión de CMH clase II se ubicaron en el área de células B, pero se observaron células positivas de CMH clase II dispersas en el área de células T (datos no mostrados). La proporción de células que expresaban HLA-DR fue de aproximadamente el 50% (tabla 5). En cinco muestras, el número de células HLA-DR + superó el número de células B, lo que indica que algunas células T en los agregados (31-89% de las células CD3+en estas muestras individuales) también expresan HLA-DR. Se obtuvieron resultados similares con tres muestras analizadas para la expresión de HLA-DQ (tabla 5).

Curiosamente, la integrina aEß7, que está presente en un gran número de LEI en el intestino normal, se expresó en el 26 (13)% de las células de los agregados (figura 1C, tabla 5). Las células positivas mostraron una distribución heterogénea, con algunas áreas con muchas células positivas y otras con pocas células positivas. Las células de expresión AE mostraron variación en la intensidad de la tinción (fig1C).

Un tercio de los linfocitos de los agregados expresaban la proteína antiapoptótica bcl-2 (fig.1F, tabla 5). Las células de expresión de Bcl-2 se dispersaron por todo el agregado. En folículos solitarios normales se observó aproximadamente el 10% de las células bcl-2 positivas. Todos estaban ubicados en la zona de celdas B.

EL ANÁLISIS ULTRAESTRUCTURAL DE CÉLULAS T γδ EN EL COLON DE LA CU MOSTRÓ INTERNALIZACIÓN Y REGULACIÓN A LA BAJA DE LA SUPERFICIE DE TcR-γδ

La investigación de microscopía inmunoelectrónica se centró en las células T γδ en el colon de la CU. Para fines comparativos, también analizamos las células T γδ en la mucosa colónica normal. El TcR-γδ se detectó como depósitos del producto de reacción densa de electrones.

En el colon normal, el producto de reacción se distribuyó homogéneamente en la superficie celular de todas las células T γδ encontradas, tanto en las ubicadas en la lámina propia (fig.5A) como en las células T γδ intraepiteliales (fig. 5B).

En contraste, las células T γδ en el colon CUCI mostraron una variabilidad extrema en la distribución del producto de la reacción desde la superficie celular hasta el citoplasma. Identificamos cinco tipos de patrones de tinción (cinco morfotipos). las células T γδ del primer tipo (fig.6A) mostraron una distribución heterogénea del producto de reacción en la superficie celular. Algunos exhibieron cuerpos multivesiculares teñidos positivamente individuales. En las células T γδ del segundo tipo, el producto de reacción se vio como escasos grupos lineales distribuidos más o menos aleatoriamente sobre la superficie celular (fig.6B). Además, algunos depósitos agrupados se localizaron sobre y dentro de invaginaciones superficiales que variaban de fosas poco profundas a invaginaciones más profundas en forma de matraz (figura 6B, recuadro). No fue posible utilizar tintes adicionales. Por lo tanto, aunque algunas de las invaginaciones de superficie se asemejaban a fosas recubiertas, no pudimos determinar si estas invaginaciones estaban recubiertas o no. En las células T γδ del tercer tipo, el producto de reacción se localizó como grupos de superficie celular, y también en vacuolas citoplasmáticas con características morfológicas de endosomas (fig.6C). En las células T γδ del cuarto tipo, el producto de reacción estaba abundantemente presente en el citoplasma, pero apenas detectable en la superficie celular (fig.6D, E, F). El producto de la reacción tiñó numerosas vesículas y vacuolas citoplásmicas cerca de la membrana celular y también en lo profundo de las células cercanas al núcleo. A veces se observaron vesículas teñidas positivamente en continuidad con la membrana plasmática y se parecían a vesículas recubiertas (fig.6E). También se tiñeron numerosos cuerpos multivesiculares formados por microvesículas compactas (fig.6F). las células T γδ del quinto tipo fueron raras (fig.6G, H). Este morfotipo generalmente mostró una fuerte tinción positiva de la membrana plasmática y el espacio perinuclear. A veces, el producto de la reacción tiñó diversas vacuolas citoplasmáticas de diferentes tamaños y formas. No se observaron diferencias obvias entre las muestras individuales de colon con CUCI estudiadas.

En resumen, la mayoría de las células T γδ (morfotipos 1-4) en el colon de la CUCI exhibieron localización celular del producto de reacción que probablemente reflejaba los diferentes pasos consecutivos de internalización de la TcR: formación de racimos, fosas recubiertas, vesículas recubiertas, endosomas y cuerpos multivesiculares.30 Un pequeño número de células (morfotipo 5) mostraron síntesis activa de moléculas TCR-γδ.