Kalmoduliini
Kalmoduliinin yhteisvaikutukset Ca2+: n ja NOS: n kanssa
CaM on pieni Ca2+: aa sitova proteiini (molekyylipaino 17 kDa), joka koostuu kahdesta samanlaisesta pallomaisesta lohkosta, joita yhdistää keskusyhteysalue. Jokainen lohko sisältää kaksi E-F kättä, jotka sisältävät N-terminaalinen helix (e helix), keskeisellä paikalla Ca2+ koordinoiva silmukka, ja C-terminaalinen helix (F helix) (verkkotunnukset CaM on yleensä merkitty 1-4 N-C terminaali). Ca2+: n sitoutuessa CaM pystyy sitoutumaan ja aktivoimaan yli 30 kohdeentsyymiä, jolloin se pystyy säätelemään lukuisia toisen lähettimen ja solun toimintoja. Kohdeproteiinien sitoutuminen ja täysi aktivoituminen CaM: n avulla edellyttää yleensä kaikkien neljän Ca2+-sitoutumiskohdan miehittämistä CaM: ssä. Karboksin terminaalilohkossa on kaksi korkean affiniteetin Ca2+ – sidoskohtaa, kun taas aminoterminaalilohkossa on kaksi kohtaa, joilla on alempi Ca2+ – affiniteetti. Konformaatiomuutoksia tapahtuu CaM: ssa sen sitouduttua Ca2+: aan: hydrofobiset pintajäämät altistuvat, jolloin muodostuu ratkaisevia van der Waals-vuorovaikutuksia kohdepeptidin tunnistuskohdan hydrofobisen pinnan kanssa.
CaM sitoutuu kuhunkin nos-alayksikköön stoikiometriassa 1: 1 kohtuullisen suurella affiniteetilla. Sitoutumisaffiniteettitutkimukset peptideillä, jotka vastaavat nos CaM-tunnistussekvenssejä, osoittavat, että kolmella nos: lla on erilaisia affiniteetteja CaM: iin nähden, ja yleinen järjestys on sytokiini-indusoituva NOS (iNOS) ≫ neuronaalinen NOS (nNOS) ≈ endoteelinen NOS (Enos). INOS-peptidi sitoutuu hyvin CaM: iin sekä Ca2+: n läsnä ollessa että sen puuttuessa, mutta Enos-ja nNOS-peptidit sitoutuvat CaM: hen vain Ca2+: n läsnä ollessa.
kukin CaM-lohko sitoutuu itsenäisesti NOS: iin ja osoittaa erilaisia affiniteetteja NOS: iin nähden. nNOS näyttää korkean rakenteellisen spesifisyyden CaM-domeeneihin 1, 3 ja mahdollisesti 4 liittyen heme-pelkistyksen aktivointiin eikä synteesiin. CaM-nNOS-vuorovaikutukset ovat erityisen tärkeitä elektroninsiirrossa ja niihin liittyy cam-alueen (cam-domeenien 1 ja 3 muodostama) ja metioniinijäämä domeenissa 4. Nämä alueet CaM näyttävät vuorovaikutuksessa vielä tuntemattomia alueita nNOS, jotka ovat erillisiä sen kanoninen CaM-sitova sekvenssi. Myös keskuslinkerin varauksen ja pituuden on havaittu vaikuttavan Inosin sitoutumiseen ja aktivoitumiseen sähköstaattisen vuorovaikutuksen kautta keskuslinkerässä ja hydrofobisen vuorovaikutuksen kautta pallomaisessa cam-vyöhykkeessä, joka näyttää olevan vastuussa sen tiiviistä assosioitumisesta iNOS: iin. CA2+ dissosiaatio n-terminaalilohkosta tapahtuu kahdessa peräkkäisessä vaiheessa: nopea Ca2+ dissosiaatio N-terminaalilohkosta tapahtuu ensin ja vastaa NO-synteesin inaktivaatiota, jota seuraa hitaampi Ca2+ dissosiaatio C-terminaalilohkosta, mikä johtaa CaM: n dissosiaatioon NOS: sta. Konformaatiomuutoksia tapahtuu nos: ia sitovissa peptideissä, kun ne sitovat nokan. Tyypillisesti peptidit saavat α-kierteisen konformaation ollessaan vuorovaikutuksessa Ca2+: n sitoutuneen nokan kanssa. Nos-reduktaasin domeenissa tapahtuu myös CaM-indusoitu konformaatiomuutos, joka ilmenee proteiinin ja flaviinin fluoresenssin muutoksena ja trypsiinin proteolyysimallin muutoksena.
on saatavilla Enos CaM-tunnistussekvenssiä vastaavaan 20-jäämäpeptidiin sitoutuneen Ca2+ – kuormitetun nokan kristallografinen rakenne. Rakenne paljasti, että α-kierteinen Enos-peptidi sitoutuu CaM: hen antiparallel-orientaatiossa laajojen hydrofobisten vuorovaikutusten kautta: CaM: n N – terminaaliset ja C-terminaaliset lohkot kietoutuvat sitoutuneen peptidin ympärille ja vuorovaikuttavat peptidin C-ja N-terminaalisten puoliskojen kanssa. Erityiset cam-jäämät salvan alueella ja verkkotunnuksessa 4 oli sijoitettu tavalla, joka vastasi niiden merkitystä mutageenisuustutkimusten perusteella. Kiderakenne ehdotti myös pohjaa tiukemmalle Nokansidonnalle inosissa: koska inos sisältää suuremman määrän hydrofobisia jäämiä vastaavassa CaM-tunnistusjaksossa, väitettiin, että nämä tukisivat laajempia van der Waalsin kontakteja CaM: n kanssa ja minimoisivat hydrofobisten jäämien epäsuotuisan liuotinaltistuksen, jotta voitaisiin suosia tiukempaa yhteyttä CaM: n ja Inos CaM: n tunnistusjakson välillä.
Ca2+/CaM: n ja ihmisen Inosin FMN-domeenin välisen kompleksin kiderakenne on myös saatavilla. Kompleksin rakenteessa tunnistettiin neljä erilaista konformaatiota, mikä osoittaa CaM–ja FMN-domain-domain-vuorovaikutusten joustavuuden. CaM: n ja FMN: n domeenin välille muodostunut suolasilta näkyy rakenteessa, ja se voi olla tärkeä muunnettaessa CaM: n sitoutumisen vaikutusta NOS: n funktioihin.