Caractérisation des agrégats lymphoïdes muqueux dans la colite ulcéreuse: phénotype des cellules immunitaires et expression de la TcR-γδ | Intestin

Résultats

LES LEUCOCYTES CONSTITUENT LE PRINCIPAL TYPE CELLULAIRE DANS LE CÔLON UC ENFLAMMÉ ET SE RÉPARTISSENT DIFFÉREMMENT DANS LA MUQUEUSE COLIQUE DES PATIENTS UC PAR RAPPORT AUX TÉMOINS

Douze échantillons de côlon sigmoïde enflammé provenant de patients UC et 15 échantillons de CÔLON sigmoïde apparemment normal provenant de patients sans antécédents de colite ulcéreuse Les MII ont été soumises à une analyse phénotypique par immunohistochimie. Neuf de ces échantillons de CU ont été classés comme gravement malades. Dans ceux-ci, l’épithélium était aplati avec un nombre réduit de cellules caliciformes, de cryptes ramifiées et d’ulcérations occasionnelles. Les abcès de la crypte étaient fréquents. La lamina propria contenait de nombreux leucocytes dispersés ainsi que des agrégats lymphoïdes basaux (figure 1A). Trois spécimens d’UC ont été classés comme modérément malades. Dans tout l’épithélium était intact avec un nombre légèrement réduit de cellules caliciformes et pas / peu de cryptes ramifiées. La lamina propria contenait un nombre accru de leucocytes et des agrégats lymphoïdes étaient présents. L’analyse morphométrique s’est concentrée sur les agrégats.

Les agrégats comprenaient des amas de lymphocytes fusionnants nodulaires sans centres réactifs typiques. Ils étaient situés entre les bases des cryptes et la sous-muqueuse sans contact apparent avec l’épithélium luminal (figure 1A). Cependant, une proximité étroite entre les cellules des agrégats et l’épithélium de la crypte a souvent été notée (figure 1A, D). La fréquence des agrégats (nombre/surface) était similaire dans les tissus modérément et gravement malades, allant de 1,3 à 4,9 agrégats par mm2 de lamina propria (tableau 3). Cependant, la surface de la lamina propria occupée par les agrégats augmentait avec la gravité de la maladie et représentait jusqu’à 45% de la lamina propria dans le côlon gravement malade chez certains patients (tableau 3). Les follicules solitaires normaux du côlon témoin étaient peu fréquents (moins de 0,1 follicule/mm2 de lamina propria, n = 8).

Environ 75% des cellules des agrégats étaient des leucocytes (74 (7) % de cellules CD45+ (n = 9)). La proportion de leucocytes dans les follicules lymphoïdes solitaires était également élevée (67 (6)% de cellules CD45+ (n = 8)). Les deux valeurs peuvent être sous-estimées car la coloration avec l’anti-CD45 mAb était hétérogène. Cette coloration hétérogène peut s’expliquer, au moins en partie, par une diminution de l’expression de CD45 sur les cellules B activées.

Le nombre de leucocytes à la fois dans la lamina propria en dehors des agrégats (26 (7)% de cellules CD45 + (n = 4)) et dans la sous-muqueuse (8 (2)% de cellules CD45 + (n = 4)) a été augmenté dans le côlon UC par rapport au côlon normal (15 (2)% de cellules CD45 + dans la lamina propria en dehors des follicules et 4 (2)% de cellules CD45 + dans la sous-muqueuse (n = 4)).

Les leucocytes intraépithéliaux étaient présents à des fréquences plus faibles dans le côlon UC par rapport au côlon normal: 28 (7) cellules CD45+ / 1000 cellules épithéliales dans le tissu colique gravement malade (n = 4) par rapport à 66 (26) cellules CD45+ / 1000 cellules épithéliales chez les témoins (n = 4, p = 0,03). Les IEL ont été principalement détectées dans l’épithélium cryptal du côlon UC, en partie en raison d’érosions de l’épithélium de surface luminale. Dans le côlon normal, > 60% des IEL étaient situés dans l’épithélium luminal. Ainsi, comme la densité de l’IEL est plus faible dans l’épithélium cryptal que dans l’épithélium luminal dans le côlon normal, la fréquence plus faible de l’IEL dans le côlon UC peut s’expliquer par le fait que le côlon UC contient principalement de l’épithélium cryptal.

LES AGRÉGATS DANS LE TISSU COLIQUE DES PATIENTS ATTEINTS DE CU COMPRENNENT PRESQUE EXCLUSIVEMENT DES LYMPHOCYTES T ET B

Les agrégats ont été analysés pour la présence des trois principaux types de lymphocytes: les lymphocytes T (mAb anti-CD3), les lymphocytes B (un mélange de MAB anti-CD19, anti-CD20 et anti-CD22) et les cellules NK. Pour l’analyse des cellules NK, le mAb anti-CD57 a été choisi car nous avons précédemment montré que des cellules T αβ et γδ exprimant le marqueur cellulaire NK classique CD56 sont présentes dans l’intestin humain.25 Anti-CD15 a été utilisé pour détecter les granulocytes, anti-CD14 pour les monocytes sanguins / macrophages récemment recrutés et anti-CD68 pour les macrophages tissulaires. Pour détecter les cellules dendritiques folliculaires (FDC), trois MAB différents ont été utilisés (tableau 2). L’Anti-CD80 / B7.1 a été utilisé pour détecter les cellules présentant une fonction de présentation d’antigène et l’anti-CD1a a été utilisé comme marqueur supplémentaire pour les cellules dendritiques / de Langerhans. Les résultats de l’analyse immunomorphométrique sont résumés sur la figure 3. Les deux principaux types de cellules étaient les cellules T et B et la somme des cellules CD3+ et CD19/20/22+ les cellules ont égalé le nombre de cellules CD45+ dans la plupart des échantillons (77 (12) % par rapport à 74 (7) % de cellules CD45+ (n = 9)). Les cellules T et B constituaient des proportions également importantes des cellules dans les agrégats. Les agrégats contenaient de grandes zones de lymphocytes T sans lymphocytes B et des zones réciproques dominées par des lymphocytes B avec seulement quelques lymphocytes T dispersés (figure 2A, B). La plupart des agrégats étaient constitués de cellules densément emballées, mais dans certains cas, des zones limitées de cellules plus faiblement emballées ont été détectées dans la zone des lymphocytes B. La proportion de cellules B était significativement plus élevée dans les agrégats du côlon UC gravement malade que dans les tissus modérément malades (43 (8) v 30 (6); p = 0,03), suggérant une importance accrue des cellules B dans les formes sévères de la maladie. Les follicules solitaires du côlon normal avaient une apparence légèrement différente. Le centre du follicule contenait de gros lymphocytes B faiblement emballés avec peu ou pas de lymphocytes T, entourés d’une zone de lymphocytes B et de lymphocytes T et de zones à la périphérie qui ne contenaient que des lymphocytes T (figure 2D, E).

Des cellules dendritiques folliculaires ont été détectées dans sept des neuf échantillons d’UC en utilisant trois MAB anti-FDC différents. Aucune différence dans les motifs de coloration n’a été observée entre les trois MAB. Les cellules dendritiques folliculaires colorées positivement formaient un réseau situé dans la zone des cellules B des agrégats (figure 2B, C). Bien que chaque agrégat contienne au moins une zone de cellules B, seulement environ 40% contiennent un réseau FDC. Les réseaux FDC n’ont jamais été observés dans les zones à cellules T. Dans le côlon normal, chaque follicule contenait un réseau FDC qui était confiné à la zone des lymphocytes B (figure 2E, F). CD80/B7.des cellules dendritiques 1+ étaient également présentes dans les agrégats du côlon UC. Ils étaient le plus souvent considérés comme des cellules dendritiques uniques entourées de petits points CD80+ entre les lymphocytes, probablement des sections transversales de protubérances dendritiques. On peut parfois voir un réseau complet de cellules CD80+ (figure 1E). Ce réseau était situé dans une zone à cellules T. Aucune cellule CD1a+ présentant une morphologie dendritique n’a été détectée dans les agrégats.

Bien que la proportion de granulocytes, cellules CD15+, soit élevée dans la plupart des échantillons d’UC, ces cellules étaient généralement situées en dehors des agrégats (figure 3). De nombreux macrophages tissulaires, cellules CD68+, étaient présents dans la lamina propria en dehors des agrégats. Dans les agrégats, ils étaient rares et situés dans le bord extérieur (figure 3). Dans le côlon normal, la plupart des cellules CD68+ étaient localisées à proximité de l’épithélium luminal.29 Agrégats avec un nombre significatif de cellules CD14+ ont été observés dans seulement deux échantillons. Ces échantillons présentaient également une fréquence élevée de cellules CD14+ dans la sous-muqueuse (c’est-à-dire ≈3,5% de cellules CD14 + par rapport à ≈1% de cellules CD14 + dans d’autres échantillons du côlon UC et du côlon témoin). De plus, les cellules CD14+ étaient concentrées près des vaisseaux sanguins, suggérant une invasion continue des monocytes. Il n’y avait aucun paramètre clinique évident qui pouvait expliquer pourquoi l’invasion de monocytes s’était produite, en particulier dans ces deux échantillons. Les cellules NK, les cellules CD57+, étaient rares à la fois dans les tissus UC et normaux du côlon et n’étaient détectées qu’occasionnellement dans les agrégats (fig3).

Les agrégats lymphoïdes du côlon UC ne différaient pas significativement des follicules solitaires du côlon normal en ce qui concerne le nombre de lymphocytes T, de lymphocytes B, de macrophages / monocytes, de granulocytes et de cellules NK (figure 3). De plus, un réseau FDC situé dans la zone des cellules B a été observé dans les deux types de structures. Cependant, les agrégats n’avaient pas de zone typique de cellules B en forme de centre germinal avec des cellules B faiblement emballées, ce qui est visible dans les follicules solitaires normaux. De plus, les agrégats du côlon UC occupaient jusqu’à 45% de la lamina propria.

LES AGRÉGATS DU CÔLON UC SONT COLONISÉS PAR DES LYMPHOCYTES T γδ

Un nombre étonnamment élevé de cellules dans les agrégats étaient des lymphocytes T γδ (11 (7%) cellules TcR-γδ+ (n = 9)) (figure 1B, 3). En revanche, presque aucune cellule T γδ n’a été détectée dans les follicules du côlon normal (0,3 (0.3) % de cellules TCR-γδ+ (n = 8) (p < 0,001)) (figure 3). Le nombre de cellules TCR-γδ+ dans les agrégats augmentait avec la gravité de la maladie. Le rapport des cellules TCR-αβ+ aux cellules TCR-γδ+ dans les agrégats était de 2,4 (0,9) dans les échantillons d’UC gravement malades (n = 6) mais variait de 1,3 à 42 dans les échantillons modérément malades (n = 3) et était > 300 dans les follicules du côlon normaux. Dans cinq échantillons, les fréquences des lymphocytes T γδ à la fois dans les agrégats et dans les lamina propria en dehors des agrégats ont été déterminées. Dans les agrégats, la fréquence des cellules TCR-γδ+ était de 3,9 (2.5) fois plus élevé qu’en dehors des agrégats. Les cellules TCR-γδ+ dans les agrégats ont principalement exprimé Vδ1 alors que la plupart des cellules utilisant Vδ2 ont été trouvées en dehors des agrégats. La fraction LPL totale a été analysée pour l’utilisation du gène Vδ par cytométrie par immunoflow sur des cellules isolées. En accord avec les résultats immunohistochimiques, 86 (10)% des cellules TcR-γδ+ ont exprimé Vδ1 tandis que les cellules restantes ont exprimé Vδ2 (tableau 4). Conformément à l’analyse ultrastructurale des cellules T γδ+ (voir ci-dessous), la coloration des cellules TCR-γδ+ a souvent montré un aspect inégal ou tacheté en immunohistochimie (figure 1B, encart) et a montré une intensité de fluorescence relativement faible en cytométrie immunoflow (figure 4). En raison du motif de coloration hétérogène pour TcR-γδ, le nombre de cellules T γδ+ peut être sous-estimé. L’analyse par cytométrie par immunoflux en deux couleurs de LPL isolée a montré que presque toutes les cellules T γδ+ exprimaient CD45R0. Jusqu’à 15% des lymphocytes T γδ+ exprimaient CD8 mais la plupart des lymphocytes T γδ+ étaient double négatifs CD4/CD8.

LES LYMPHOCYTES T CD4+ CD28−αβ CONSTITUENT LE PRINCIPAL SOUS-TYPE DE LYMPHOCYTES T DANS LES AGRÉGATS

La majorité des lymphocytes T dans les agrégats exprimés en TcR-αβ et la proportion de cellules CD4+ était supérieure à la proportion de cellules CD8+ (figure 3) avec un rapport CD4 / CD8 moyen de 1,7 (0.7) (n = 8). La dominance des cellules CD4+ était encore plus prononcée lorsque des LPL isolées ont été analysées (figure 4). L’analyse par cytométrie par immunoflux en deux couleurs de la LPL a montré que presque toutes les cellules CD4+ exprimaient la TcR-αβ (données non présentées). Les cellules CD8+ n’ont été trouvées que dans la zone des lymphocytes T des agrégats tandis que les cellules CD4+ étaient présentes à la fois dans la zone des lymphocytes T et dispersées dans la zone des lymphocytes B. Dans plusieurs échantillons, la somme des cellules CD4+ et CD8+ dépassait le nombre de cellules CD3+ et/ou de cellules TcR+. Cela reflète probablement une sous-estimation des cellules T en raison de la faible expression du complexe CD3/ TcR plutôt que de la présence de cellules doubles positives CD4 / CD8 car seulement 2,4 (1,3)% (n = 4) de la LPL totale étaient doubles positives dans l’analyse de cytométrie par immunoflux (figure 4). Bien que de nombreuses cellules exprimant le co-récepteur des lymphocytes T CD28 aient été dispersées dans la lamina propria en dehors des agrégats (13 (2)% de cellules CD28+ (n = 3)), aucune cellule CD28+ n’a été détectée dans les agrégats (tableau 5; figure 1D).

Il n’y a pas eu de différences significatives dans les fréquences et les phénotypes des sous-ensembles de cellules T αβ entre les agrégats du côlon UC et les follicules solitaires du côlon témoin (figure 3).

LA PLUPART DES CELLULES B DES AGRÉGATS EXPRIMENT DES IgM À LEUR SURFACE

La majorité des cellules de la zone des cellules B des agrégats ont montré une coloration par mAb anti-IgM (42 (5)% de cellules IgM + (n = 4)) correspondant à 95 (7)% du CD19/20/22+ cellules. Cependant, pas moins de 19 (2)% des cellules des agrégats ont exprimé des IgA et une petite fraction des cellules IgG+ (3,3 (0,4)% (n = 4)) ont également été détectées. Ces données suggèrent que les cellules B dans les agrégats expriment plus d’un isotype d’immunoglobuline et pourraient avoir récemment subi un changement de classe. Aucune cellule Ig+ n’a montré de coloration cytoplasmique, indiquant que les plasmocytes n’étaient pas présents dans les agrégats. En revanche, des cellules plasmatiques ont été trouvées en dehors des agrégats.

Cellules IgM+ (28 (2)% (n = 4)) plus nombreuses que les cellules IgA+ (14 (1)% (n = 4)) et les cellules IgG+ (2,2 (0,4)% (n = 4)) dans les follicules du côlon témoin. Cependant, la somme des cellules Ig+ égalait le nombre de CD19/20/22+ cellules dans des échantillons individuels. Plus intéressant encore, bien qu’il n’y ait pas de différence significative dans le nombre de cellules B dans les follicules par rapport aux agrégats (figure 3), la proportion de cellules IgM + de surface, de cellules IgA + de surface et de cellules IgG + de surface était significativement plus élevée dans les agrégats du côlon UC que dans les follicules du côlon témoin (p < 0,01 pour les trois isotypes).

EXPRESSION DE MARQUEURS NON RESTREINTS DE SOUS-TYPE DANS LES AGRÉGATS LYMPHOÏDES DU CÔLON UC

Environ 50% des cellules des agrégats lymphoïdes ont exprimé le marqueur mémoire/activation CD45R0 (tableau 5). De plus, l’analyse de LPL isolé a montré que les cellules exprimant CD45R0 et CD45RA constituaient chacune environ 50% de la population (n = 4). La majorité des cellules CD3+ exprimaient CD45R0 mais une fraction significative de cellules CD45RA exprimant CD3+ étaient également présentes (figure 4). La majorité des cellules exprimant CD45R0 étaient des cellules T et 20 à 40% des cellules CD45R0+ étaient des cellules B. Dans deux échantillons, la somme des cellules exprimant CD45R0 et CD45RA a dépassé 100%, ce qui suggère que les cellules exprimant les deux variantes d’épissure peuvent être présentes simultanément.

La majorité des cellules exprimant le CMH de classe II étaient situées dans la zone des lymphocytes B, mais des cellules positives dispersées de classe II du CMH ont été observées dans la zone des lymphocytes T (données non présentées). La proportion de cellules exprimant HLA-DR était d’environ 50% (tableau 5). Dans cinq échantillons, le nombre de cellules HLA-DR+ dépassait le nombre de cellules B, ce qui indique que certaines cellules T dans les agrégats (31 à 89% des cellules CD3+ dans ces échantillons individuels) expriment également HLA-DR. Des résultats similaires ont été obtenus avec trois échantillons analysés pour l’expression de HLA-DQ (tableau5).

Il est intéressant de noter que l’intégrine aEß7, présente sur un grand nombre d’IEL dans l’intestin normal, a été exprimée sur 26 (13)% des cellules des agrégats (figure 1C, tableau 5). Les cellules positives ont montré une distribution hétérogène, avec certaines zones avec beaucoup de cellules positives et d’autres zones avec peu de cellules positives. Les cellules d’expression AE ont montré une variation de l’intensité de la coloration (fig1C).

Un tiers des lymphocytes dans les agrégats a exprimé la protéine antiapoptotique bcl-2 (figure 1F, tableau 5). Les cellules exprimant la Bcl-2 ont été dispersées sur l’ensemble de l’agrégat. Dans les follicules solitaires normaux, environ 10% des cellules positives de la bcl-2 ont été observées. Ils étaient tous situés dans la zone des cellules B.

L’ANALYSE ULTRASTRUCTURALE DES LYMPHOCYTES T γδ DANS LE CÔLON UC MONTRE UNE INTERNALISATION ET UNE RÉGULATION DESCENDANTE DE SURFACE DE LA TcR-γδ

L’étude en microscopie immunoélectronique a porté sur les lymphocytes T γδ dans le côlon UC. À des fins comparatives, nous avons également analysé les lymphocytes T γδ dans la muqueuse colique normale. Le TcR-γδ a été détecté comme des dépôts du produit de réaction dense aux électrons.

Dans le côlon normal, le produit de réaction a été réparti de manière homogène sur la surface cellulaire de tous les lymphocytes T γδ trouvés, à la fois sur ceux situés dans la lamina propria (figure 5A) et sur les lymphocytes T γδ intraépithéliaux (figure 5B).

En revanche, les lymphocytes T γδ du côlon UC présentent une variabilité extrême de la distribution du produit de réaction de la surface cellulaire au cytoplasme. Nous avons identifié cinq types de motifs de coloration (cinq morphotypes). les lymphocytes T γδ du premier type (figure 6A) ont montré une distribution hétérogène du produit de réaction à la surface cellulaire. Certains présentaient des corps multivésiculaires à coloration positive unique. Dans les lymphocytes T γδ du second type, le produit de réaction a été vu comme de rares amas linéaires répartis plus ou moins aléatoirement sur la surface cellulaire (figure 6B). De plus, certains dépôts groupés ont été localisés au-dessus et à l’intérieur d’invaginations de surface qui variaient de fosses peu profondes à des invaginations plus profondes en forme de flacon (figure 6B, encart). Il n’était pas possible d’utiliser une contre-coloration supplémentaire. Ainsi, bien que certaines des invaginations de surface ressemblaient à des fosses revêtues, nous n’avons pas pu déterminer si ces invaginations étaient revêtues ou non. Dans les lymphocytes T γδ du troisième type, le produit de réaction a été localisé sous forme d’amas de surface cellulaire, ainsi que dans des vacuoles cytoplasmiques présentant des caractéristiques morphologiques d’endosomes (figure 6C). Dans les lymphocytes T γδ du quatrième type, le produit de réaction était abondamment présent dans le cytoplasme mais à peine détectable à la surface cellulaire (figure 6D, E, F). Le produit de réaction a coloré de nombreuses vésicules cytoplasmiques et vacuoles près de la membrane cellulaire et aussi profondément dans les cellules proches du noyau. Des vésicules colorées positivement ont parfois été vues en continuité avec la membrane plasmique et ressemblaient à des vésicules revêtues (figure 6E). De nombreux corps multivésiculaires constitués de microvésicules serrées ont également été colorés (figure 6F). les lymphocytes T γδ du cinquième type sont rares (figure 6G, H). Ce morphotype montre généralement une forte coloration positive de la membrane plasmique et de l’espace périnucléaire. Parfois, le produit de réaction a coloré diverses vacuoles cytoplasmiques de différentes tailles et formes. Aucune différence évidente entre les échantillons individuels du côlon UC étudiés n’a été observée.

En résumé, la majorité des lymphocytes T γδ (morphotypes 1-4) dans le côlon UC présentaient une localisation cellulaire du produit de réaction reflétant très probablement les différentes étapes consécutives de l’internalisation du TcR: formation d’amas, de fosses enrobées, de vésicules enrobées, d’endosomes et de corps multivésiculaires.30 Un petit nombre de cellules (morphotype 5) ont montré une synthèse active de molécules TcR-γδ.