A nyálkahártya lymphoid aggregátumainak jellemzése colitis ulcerosában: immunsejt fenotípus és TCR-expression | gut

eredmények

a leukociták alkotják a fő sejttípust a gyulladt UC vastagbélben, és eltérően oszlanak meg az UC betegek VASTAGBÉLNYÁLKAHÁRTYÁJÁBAN, összehasonlítva a kontrollokkal

tizenkét mintát gyulladt sigmoid vastagbélből UC betegekből és 15 mintát látszólag normális sigmoid vastagbélből olyan betegekből, akiknek a kórtörténetében nem szerepelt IBD fenotípusos elemzés immunhisztokémiával. Ezen UC minták közül kilencet súlyosan betegként osztályoztak. Ezekben a hám lapított csökkent számú serleg sejtek, elágazó kripták, és alkalmi fekélyek. A kripta tályogok gyakoriak voltak. A lamina propria számos szétszórt leukocitát, valamint bazális limfoid aggregátumot tartalmazott (1A.ábra). Három UC mintát Közepesen betegként osztályoztak. Az összes epithelium ép volt, enyhén csökkent számú serlegsejtek és nem / néhány elágazó kripták. A lamina propria megnövekedett számú leukocytát tartalmazott, és lymphoid aggregátumok voltak jelen. A morfometriai elemzés az aggregátumokra összpontosított.

az aggregátumok a limfociták noduláris összeolvadó klasztereit tartalmazták, tipikus reaktív központok nélkül. A kripták alapjai és a submucosa között helyezkedtek el, anélkül, hogy a luminalis epitheliummal érintkeztek volna (1A.ábra). Az aggregátumok sejtjei és a kripta epithelium közötti közelséget azonban gyakran észlelték (1A., D. ábra). Az aggregátumok gyakorisága (szám/terület) hasonló volt a közepesen és súlyosan beteg szövetekben, 1,3-4,9 aggregátum / mm2 lamina propria tartományban (3.táblázat). A lamina propria aggregátumok által elfoglalt területe azonban a betegség súlyosságával növekedett, és néhány beteg esetében a lamina propria 45% – át tette ki súlyosan beteg vastagbélben (3.táblázat). A kontroll vastagbél normális szoliter tüszői ritkán fordultak elő (kevesebb, mint 0,1 tüsző/mm2 lamina propria, n=8).

az aggregátumok sejtjeinek körülbelül 75% – a leukocita volt (74 (7) % CD45+ sejt (n = 9)). A leukociták aránya a magányos limfoid tüszőkben szintén magas volt (67 (6)% CD45+sejt (n=8)). Mindkét érték alábecsülhető, mivel az anti-CD45 mAb festés heterogén volt. Ez a heterogén festés legalább részben magyarázható a CD45 csökkent expressziójával az aktivált B-sejteken.

a leukocyták száma mind az aggregátumokon kívüli lamina propria-ban (26 (7)% CD45+ sejt (n=4)), mind a submucosa-ban (8 (2)% CD45+ sejt (n=4)) nőtt az UC colon-ban a normál vastagbélhez képest (15 (2)% CD45+ sejt a lamina propria-ban a tüszőkön kívül és 4 (2)% CD45+sejt a submucosa-ban (n=4)).

az intraepithelialis leukociták alacsonyabb gyakorisággal voltak jelen az UC vastagbélben, mint a normál vastagbélben: 28 (7) CD45+ sejt/1000 hámsejt a súlyosan beteg vastagbélszövetben (n=4), szemben a kontrollok 66 (26) CD45+ sejtjével/1000 hámsejtjével (n=4, p=0,03). Az IEL-t elsősorban az UC vastagbél kriptális hámjában detektálták, részben a luminalis felszíni hám eróziója miatt. Normál vastagbélben az IEL >60% – a a luminalis hámban található. Így, mivel az IEL sűrűsége alacsonyabb a kriptálisban, mint a normál vastagbél luminális hámjában, az iel alacsonyabb gyakorisága az UC vastagbélben azzal magyarázható, hogy az UC vastagbél főleg kriptális hámot tartalmaz.

az UC-s betegek VASTAGBÉLSZÖVETÉBEN lévő aggregátumok szinte kizárólag T-és B-limfocitákat tartalmaznak

aggregátumokat elemeztek a három fő limfocitatípus jelenlétére: T-sejtek (anti-CD3 mAb), B-sejtek (anti-CD19, anti-CD20 és anti-CD22 MAB-ok keveréke) és NK-sejtek. Az NK-sejtek elemzéséhez anti-CD57 mAb-t választottunk, mivel korábban kimutatták, hogy a klasszikus nk-sejt marker cd56-ot expresszáló klasszikus T-sejtek jelen vannak az emberi bélben.25 Anti-CD15-öt használtak a granulociták kimutatására, anti-CD14-et a vér monocitáira/nemrégiben toborzott makrofágokra, anti-CD68-at pedig a szöveti makrofágokra. A follikuláris dendritikus sejtek (FDC) kimutatására három különböző MAB-ot használtunk (2.táblázat). Az antigént bemutató funkcióval rendelkező sejtek kimutatására anti-CD80/B7.1-et, a dendritikus/Langerhans sejtek kiegészítő markereként pedig anti-CD1a-t alkalmaztak. Az immunomorfometriai analízis eredményeit a 3. ábra foglalja össze. A két fő sejttípus a T és B sejtek, valamint a CD3+ sejtek és a CD19 összege volt/20/22+a sejtek a legtöbb mintában megegyeztek a CD45+ sejtek számával (77 (12)%, szemben a 74 (7)% CD45+ sejtekkel (n=9)). A t-és B-sejtek az aggregátumokban lévő sejtek egyformán nagy hányadát alkotják. Az aggregátumok nagy T-sejt területeket tartalmaztak B-sejtek nélkül, és a B-sejtek által dominált reciprok területeket csak néhány szétszórt T-sejttel (2A., B. ábra). A legtöbb aggregátum sűrűn csomagolt sejtekből állt, de bizonyos esetekben a lazán csomagolt sejtek korlátozott területeit detektálták a B-sejt zónában. A B-sejtek aránya szignifikánsan magasabb volt a súlyosan beteg UC vastagbél aggregátumaiban a közepesen beteg szövetekhez képest (43 (8)v 30 (6); p=0,03), ami a B-sejtek fokozott fontosságára utal a betegség súlyos formáiban. A normál vastagbélben lévő magányos tüszők kissé eltérő megjelenésűek voltak. A tüsző közepén lazán csomagolt nagy B-sejtek voltak, kevés T-sejttel, mind a B -, mind a T-sejtek zónájával körülvéve, valamint a periféria olyan területeivel, amelyek csak T-sejteket tartalmaztak (2D, E ábra).

a follikuláris dendritikus sejteket kilenc UC mintából hétben detektáltuk három különböző anti-FDC MAB alkalmazásával. A három MAB között nem volt különbség a festési mintákban. A pozitívan festett follikuláris dendritikus sejtek hálózatot képeztek, amely az aggregátumok B-sejtterületén helyezkedett el (2B, C ábra). Bár minden aggregátum tartalmazott legalább egy B-sejt területet, csak körülbelül 40% tartalmazott FDC hálózatot. Az FDC hálózatokat soha nem látták a T-sejtek területén. Normál vastagbélben minden tüsző tartalmazott egy FDC hálózatot, amely a B-sejt területére korlátozódott (2e, F ábra). CD80 / B7.1 + dendritikus sejtek is jelen voltak az UC vastagbél aggregátumaiban. Leggyakrabban egyetlen dendritikus sejtként tekintették őket, amelyeket kis cd80+ pontok vettek körül a limfociták között, feltehetően a dendritikus kiemelkedések keresztmetszetei. Időnként a CD80+ sejtek teljes hálózata látható volt (1E ábra). Ez a hálózat egy T-sejt területén található. Az aggregátumokban nem mutattak ki dendritikus morfológiájú CD1a+ sejteket.

bár a granulociták, a CD15 + sejtek aránya a legtöbb UC mintában emelkedett, az ilyen sejtek általában az aggregátumokon kívül helyezkedtek el (3.ábra). Számos szöveti makrofág, CD68 + sejt volt jelen a lamina propria-ban az aggregátumokon kívül. Az aggregátumokban szűkösek voltak a külső peremben (3. ábra). Normál vastagbélben a legtöbb CD68 + sejt a luminalis epithelium közelében helyezkedett el.29 szignifikáns számú CD14+ sejtet tartalmazó aggregátumot csak két mintában láttunk. Ezekben a mintákban a CD14+sejtek gyakorisága is magas volt a submucosa – ban (azaz a 3,5% – os CD14 + sejtek, szemben a többi UC vastagbélmintában és a kontroll vastagbélben lévő 6% – os CD14+ sejtekkel). Ezenkívül a CD14 + sejtek az erek közelében koncentrálódtak, ami a monociták folyamatos inváziójára utal. Nem volt nyilvánvaló klinikai paraméter, amely megmagyarázná, miért történt monocita invázió, különösen ebben a két mintában. Az NK sejtek, a CD57 + sejtek mind az UC-ben, mind a normál vastagbélszövetben ritkák voltak, és csak alkalmanként voltak kimutathatók aggregátumokban (3.ábra).

az UC colon lymphoid aggregátumai a T-sejtek, a B-sejtek, a makrofágok/monociták, a granulociták és az NK-sejtek számát tekintve nem különböztek szignifikánsan a normál vastagbélben található szoliter tüszőktől (3.ábra). Sőt, a B-sejt zónában elhelyezkedő FDC hálózatot mindkét típusú struktúrában látták. Az aggregátumokból azonban hiányzott egy tipikus csíraközpont-szerű B-sejt zóna lazán csomagolt B-sejtekkel, ami normális magányos tüszőkben látható. Ezenkívül az UC colonban lévő aggregátumok a lamina propria legfeljebb 45% – át foglalták el.

az UC colonban lévő aggregátumokat a következők kolonizálják: \ T \ T

az aggregátumokban lévő sejtek meglepően nagy száma volt \ T \ T \ T (11 (7%) TCR- \ t \ \ + sejtek (n=9)) (1b., 3. ábra). Ezzel szemben a normál vastagbél tüszőiben szinte nem mutattak ki homogén T-sejteket (0,3 (0).3) % TCR – + sejtek (n = 8) (p<0,001)) (3.ábra). Az aggregátumokban a TCR-6+ sejtek száma a betegség súlyosságával nőtt. Az aggregátumokban a TCR-6+ sejtek és a TCR-6+ sejtek aránya 2,4 (0,9) volt a súlyosan beteg UC mintákban (N=6), de 1,3 és 42 között változott a közepesen beteg mintákban (n=3), és >300 volt a normál vastagbél tüszőkben. Öt mintában határoztuk meg mind az aggregátumokban, mind az aggregátumokon kívüli lamina propria-sejtek gyakoriságát. Az aggregátumokban a TCR-6+ sejtek gyakorisága 3,9 (2.5) szer nagyobb, mint az aggregátumokon kívül. Az aggregátumokban a TCR – ++ + cellák főleg V-ben fejeződtek ki 61, míg a legtöbb V-t használó cellát az aggregátumokon kívül találták meg. A teljes LPL frakciót izolált sejteken végzett immunoflow citometriával elemeztük a V-alapú Génhasználat szempontjából. Az immunhisztokémiai eredményekkel egyetértésben a TcR-6+sejtek 86 (10)% – A V-11-et, míg a többi sejt V-2-t expresszált (4.táblázat). Összhangban az ultrastrukturális analízisével (lásd lejjebb) a TCR- ++ + sejtek festése gyakran foltos vagy foltos megjelenést mutatott az immunhisztokémián (1b.ábra, inset), és viszonylag alacsony fluoreszcencia intenzitást mutatott az immunoflow citometriában (4. ábra). A heterogén festési mintázat miatt TcR-6, a száma + a T-sejtek alulbecsültek lehetnek. Az izolált LPL két színes immunoflow citometriás elemzése azt mutatta, hogy szinte az összes ^ + T sejt cd45r0-t expresszált. A 35% – os DCC-sejtek CD8-at expresszáltak, de a legtöbb dccc+ T-sejt CD4/CD8 kettős negatív volt.

CD4 + CD28-a T-sejtek alkotják a fő T-sejt altípust az aggregátumokban

az aggregátumokban a T-sejtek többsége TCR-xhamsterben kifejezett, és a CD4+ sejtek aránya magasabb volt, mint a CD8+ sejtek aránya (3.ábra), Az átlagos CD4/CD8 Arány 1,7 (0.7) (n=8). A CD4 + sejtek dominanciája még hangsúlyosabb volt az izolált LPL elemzésekor (4.ábra). Az LPL két színes immunoflow citometriás elemzése azt mutatta, hogy szinte az összes CD4+ sejt expresszálta a TCR-t-xhamsteren (az adatok nem jelennek meg). A CD8 + sejteket csak az aggregátumok T-sejt területén találták meg, míg a CD4 + sejtek mind a T-sejt területén, mind a B-sejt területén szétszórva voltak jelen. Több mintában a CD4 + és CD8 + sejtek összege meghaladta a CD3+ sejtek és/vagy a TcR+ sejtek számát. Ez valószínűleg a T-sejtek alulbecslését tükrözi a CD3/TcR komplex alacsony szintű expressziója miatt, nem pedig a CD4/CD8 kettős pozitív sejtek jelenléte miatt, mivel a teljes LPL-nek csak 2,4 (1,3)% – A (n=4) volt kettős pozitív az immunoflow citometriás elemzésben (4.ábra). Bár számos, a T-sejt Ko-receptor CD28-at expresszáló sejt szétszóródott a lamina propria-ban az aggregátumokon kívül (13 (2)% CD28+ sejt (n=3)) az aggregátumokban nem észleltek CD28+ sejteket (5.táblázat; 1D. ábra).

az UC Colon aggregátumai és a kontroll Colon Solitaire folliculusai között nem volt szignifikáns különbség a 6.ábra szerinti T-sejt alcsoportok gyakoriságában és fenotípusában.

az aggregátumok legtöbb B-sejtje IgM-et expresszál a felületén

az aggregátumok B-sejtterületén lévő sejtek többsége anti-IgM MAB-val festődött (42 (5)% IgM + sejtek (n=4)), ami megfelel a CD19 95 (7)% – ának/20/22+ sejtek. Ugyanakkor az aggregátumokban lévő sejtek legalább 19 (2)% – a expresszált IgA-t és az IgG+ sejtek kis hányadát (3,3 (0,4)% (n=4)) is kimutatták. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az aggregátumok B-sejtjei egynél több immunglobulin izotípust expresszálnak, és a közelmúltban osztályváltáson eshettek át. Egyetlen Ig + sejt sem mutatott citoplazmatikus festést, jelezve, hogy a plazmasejtek nem voltak jelen az aggregátumokban. Ezzel szemben a plazmasejteket az aggregátumokon kívül találták.

az IgM+ sejtek (28 (2)% (n=4)) meghaladják az IgA+sejteket (14 (1)% (n=4)) és az IgG+ sejteket (2, 2 (0, 4)% (n=4)) a kontroll vastagbél tüszőiben. Az Ig + sejtek összege azonban megegyezett a CD19 számával/20/22+ sejtek az egyes mintákban. Még érdekesebb, hogy bár a tüszőkben a B-sejtek számában nem volt szignifikáns különbség az aggregátumokhoz képest (3.ábra), a felszíni IgM+sejtek, a felszíni IgA+ sejtek és a felszíni IgG+sejtek aránya szignifikánsan magasabb volt az UC vastagbél aggregátumaiban, mint a kontroll vastagbél tüszőiben (p<0,01 mindhárom izotípus esetében).

a nem korlátozott altípusú markerek expressziója az UC COLON LYMPHOID AGGREGÁTUMAIBAN

a limfoid aggregátumok sejtjeinek körülbelül 50% – A fejezte ki a CD45R0 memória/aktivációs markert (5.táblázat). Ezenkívül az izolált LPL elemzése azt mutatta, hogy a cd45r0 és CD45RA expresszáló sejtek mindegyike a populáció körülbelül 50% – át tette ki (n=4). A CD3 + sejtek többsége cd45r0-t expresszált, de a CD45RA-t expresszáló CD3+ sejtek jelentős része is jelen volt (4. ábra). A cd45r0 expresszáló sejtek többsége T-sejt volt, a CD45R0+ sejtek 20-40% – A B-sejt volt. Két mintában a CD45R0 és CD45RA expresszáló sejtek összege meghaladta a 100% – ot, ami arra utal, hogy a két splice variánst expresszáló sejtek egyidejűleg jelen lehetnek.

az MHC II osztályú expresszáló sejtek többsége a B-sejt területén helyezkedett el, de szétszórt MHC II osztályú pozitív sejteket láttak a T-sejt területén (az adatok nem jelennek meg). A HLA-DR-t expresszáló sejtek aránya körülbelül 50% volt (5.táblázat). Öt mintában a HLA-DR+ sejtek száma meghaladta a B-sejtek számát, ami azt jelzi, hogy az aggregátumok egyes T-sejtjei (ezekben az egyedi mintákban a CD3+sejtek 31-89%-a) szintén HLA-DR-t expresszálnak.hasonló eredményeket kaptunk három mintával a HLA-DQ expresszió szempontjából elemezve (5. táblázat).

érdekes módon a normál bélben nagyszámú IEL-en jelen lévő integrin ae ae 7 az aggregátumokban lévő sejtek 26 (13)% – án expresszálódott (1C ábra, 5.táblázat). A pozitív sejtek heterogén eloszlást mutattak, egyes területeken sok pozitív sejt volt,más területeken pedig kevés pozitív sejt. Az aeexpresszáló sejtek a festés intenzitásának változását mutatták (fig1C).

az aggregátumokban lévő limfociták egyharmada expresszálta a bcl-2 antiapoptotikus fehérjét (1F ábra, 5.táblázat). A Bcl-2 expresszáló sejteket szétszórtuk az egész aggregátumon. Normál magányos tüszőkben a bcl-2 pozitív sejtek körülbelül 10% – át figyelték meg. Mindannyian a B-sejt zónában voltak.

ultrastrukturális analízis a UC vastagbélben a TCR INTERNALIZÁCIÓJÁT és felszíni DOWNREGULÁCIÓJÁT mutatja-6

az immunoelektronmikroszkópos vizsgálat a UC vastagbélben lévő T-sejtekre összpontosított. Összehasonlító célokra is elemeztük a normál vastagbél nyálkahártyájában lévő T-sejteket. A TCR-xhamstereket az elektronsűrű reakciótermék lerakódásaiként detektáltuk.

normál vastagbélben a reakciótermék homogénen oszlott el az összes megtalált homogén T-sejt sejtfelszínén, mind a lamina propria-ban (5a.ábra), mind az intraepithelialis GmbH-sejteken (5B. ábra).

ezzel szemben az UC vastagbélben lévő T-sejtek rendkívül változékonyak voltak a reakciótermék eloszlásában a sejtfelszíntől a citoplazmáig. Ötféle festési mintát azonosítottunk (öt morfotípus). az első típusú T-sejtek (6a ábra) a reakciótermék heterogén eloszlását mutatták a sejtfelszínen. Néhány kiállított egyetlen pozitívan festett multivesicularis szervek. A második típusú T-sejtekben a reakcióterméket szűkös lineáris klasztereknek tekintették, amelyek többé-kevésbé véletlenszerűen oszlanak el a sejtfelszínen (6B ábra). Ezenkívül néhány csoportosított lerakódást lokalizáltak a felszíni invaginációk felett és azokon belül, amelyek a sekély gödröktől a mélyebb lombik alakú invaginációkig változtak (6B ábra, betét). Nem volt lehetséges további ellenfestést használni. Így bár a felszíni invaginációk egy része bevont gödrökre hasonlított, nem tudtuk meghatározni, hogy ezek a invaginációk bevonva vannak-e vagy sem. A harmadik típusú T-sejtekben a reakciótermék sejtfelszíni klaszterekként, valamint az endoszómák morfológiai jellemzőivel rendelkező citoplazmatikus vakuolákban helyezkedett el (6c ábra). A negyedik típusúaknál a reakciótermék bőségesen jelen volt a citoplazmában, de a sejtfelszínen alig volt kimutatható (6d, E, F ábra). A reakciótermék számos citoplazmatikus vezikulumot és vacuolát festett a sejtmembrán közelében, valamint a sejtmaghoz közeli sejtek mélyén. A pozitívan festett vezikulákat néha a plazmamembrán folytonosságában látták, és hasonlítottak a bevont vezikulákra (6e ábra). Számos, szorosan csomagolt mikrovezikulákból álló multivesikuláris testet is festettek (6F ábra). az ötödik típusú T-sejtek ritkák voltak (6g, H ábra). Ez a morfotípus általában a plazmamembrán és a perinukleáris tér erős pozitív festődését mutatta. Néha a reakciótermék különböző méretű és formájú citoplazmatikus vakuolákat festett. Nem volt nyilvánvaló különbség az egyes UC vastagbélminták között.

összefoglalva, az UC vastagbélben lévő (1-4-es morfotípusú) T-sejtek többsége a reakciótermék celluláris lokalizációját mutatta, ami valószínűleg a TCR internalizálásának különböző egymást követő lépéseit tükrözi: klaszterek, bevont gödrök, bevont vezikulák, endoszómák és multivesicularis testek kialakulását.30 kis számú sejt (5-ös morfotípus) mutatta a TCR-6 molekulák aktív szintézisét.