az lc3-pozitív struktúrák kiemelkedőek az autofágia-hiányos sejtekben

anyagok

az ebben a vizsgálatban használt antitestek: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) és az összes Alexa-konjugált másodlagos antitestet az Invitrogen-től vásárolták. A pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A és RFP-LC3 konstrukciók Dr. T. Yoshimori (Osaka Egyetem, Japán) kedves ajándékai voltak. ATG9A-pEGFP volt egy kedves ajándék Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mcherry volt Clontech (632524), mCherry-p62 és mCherry-p62 Lir mutáns (DDDW335-338aaaa) volt egy kedves ajándék Dr. Sascha Martens (Bécsi Egyetem, Ausztria), p62-pEGFP volt egy kedves ajándék Dr. Terje Johansen (Artic Egyetem, Norvégia), míg a Myc-LC3-G120A-ENTERPRISE22 Dr. T. Yoshimori (Addgene plasmid # 45449) ajándéka volt. A pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 Dr. F. Zhang (Addgene plasmid # 62988) ajándéka volt. a pCMV-ATG7 Dr. isei Tanida kedves ajándéka volt. Az EGFP-LC3K51A-t és az EGFP-LC3F52A-t a site mutagenesis hozta létre a Q5 Site-Directed mutagenesis kit (NEB E0554S) és a pEGFP-LC3 mint sablon felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően. A K51A mutációhoz használt primerek: 5 ‘- ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3 ‘ és az F52A mutációhoz: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

sejttenyészet

HeLa sejteket tenyésztettünk Dulbecco módosított Eagle Táptalajában (DMEM), 10% V/v magzati szarvasmarha szérummal, 100 egység/ml penicillin-sztreptomicinnel és 2 mM L-glutaminnal kiegészítve. A HepG2 sejteket rpmi 1640 táptalajban tartottuk fenn, kiegészítve 10% V/v magzati szarvasmarha szérummal, 100 U/ml penicillin-sztreptomicinnel, mindezt az Egyesült Királyságból származó Sigma-ból. A sejtvonalakat a sejtek áthaladásával tartottuk fenn tripszin-EDTA oldat (Sigma), miután a t75 (75 cm2 terület) lombikokban (Sólyom) körülbelül 75-90%-ra összefolynak. A vizsgálathoz használt sejtvonal a HeLa (humán méhnyakrákos sejtek) sejtvonal volt. Azokban a kísérletekben, ahol az autofágikus fluxus blokkolására volt szükség, a sejteket 400 nM bafilomicin A1-gyel kezeltük 4 órán át 37 6CC-n.

transzfekció

a HeLa sejteket transzfektáltuk a tisztított plazmiddal a Mirus TransIT-2020 transzfekciós reagens alkalmazásával. A transzfekciót optiMEM közeggel végeztük, a gyártó protokolljának felhasználásával. Röviden, 100 db OptiMem és 1 db DNS keverékét állítottuk elő és inkubáltuk szobahőmérsékleten 5 percig. Egy másik elegyet, amely 100 ml optimemet és 5 ml mirust tartalmazott, elkészítettünk, és 5 percig inkubáltuk. Ezután mindkét oldatot összekeverjük, és körülbelül 20-25 percig inkubáljuk. A teljes térfogatot ezután egy 6 lyukú lemez egyik kútjához adtuk, amely már 1 ml optimemet tartalmazott. A transzfekcióhoz általában használt DNS mennyisége 1 volt 6-kút esetén.

siRNS által közvetített leütés

az siRNS leütés sejtjeit lipofektamin 2000 transzfekciós reagenssel transzfektáltuk. A transzfekciót optiMEM közeggel végeztük, a gyártó protokolljának felhasználásával. Röviden elkészítettük a 100 ml-es optiMEM és 3 ml-es 20 ml-es vagy 1 ml-es 100 ml-es siRNS keverékét, és szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk. Ezzel egy időben egy másik, 100 ml OptiMem és 5 ml Lipofektamin 2000-et tartalmazó keveréket készítettünk, és 5 percig inkubáltuk. Ezután mindkét oldatot összekeverjük, és körülbelül 20-25 percig inkubáljuk. A teljes térfogatot ezután egy 6 lyukú lemez egyik kútjához adtuk, amely már 1 ml optimemet tartalmaz 4 órán át 37cc-N. Az inkubáció után a médiát megváltoztatták és teljes médiára cserélték. A sejteket ezután 48 órás inkubáció után gyűjtöttük be, ha egyetlen leütésre (KD) volt szükség, mint az Atg7 és ATG10 KD esetében a HeLa sejtekben. Az ATG7 és ATG10 mentési kísérletekhez egy pcdns.3 (üres vektor) vagy ATG7 plusz ATG10-zászlót használtunk a sejtek transzfektálására 24 órával az siRNS transzfekció után. Kettős KD vizsgálatokhoz az első forduló után újabb siRNS transzfekciót hajtottunk végre, a fent említett protokollt követve (p62 KD vizsgálatokhoz). A HepG2 sejtek siRNS leütéséhez ezeket lipofektamin RNAi max transzfekciós reagenssel transzfektáltuk 100 nM végső siRNS alkalmazásával, és két siRNS transzfekciót végeztünk a hatékony leütés elérése érdekében. A sejteket ezután felosztottuk, majd a megfelelő lemezekre vagy fedőlapokra vetettük további kísérletek céljából. A kódolt siRNS (ON-TARGETplus nem célzott Pool, D-001810-10), humán on-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), humán ON-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), humán on-TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) rendelték a Dharmacon-tól, és 50-100 nM végső koncentrációban használták.

GFP-trap vizsgálatok

a HeLa sejteket EGFP-LC3-mal transzfektáltuk Mirus TransIT-2020 transzfekciós reagenssel, majd 24 órával később lízispufferben lizáltuk (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) 10 percig jégen, majd 10 percig pelletálva 13 000 fordulat / perc sebességgel. A GFP-vel jelölt fehérjéket (EGFP vagy EGFP-LC3) a gyártó protokolljának megfelelően GFP-csapda gyöngyökkel (ChromoTek) húztuk le. Az immunprecipitátumokat úgy eluáltuk, hogy a mintákat Laemmli pufferben 5 percig forraltuk. A fehérjéket SDS-PAGE segítségével oldottuk meg.

immunfluoreszcencia

az immuncitokémiát 22 db 22 mm-es fedőlapon tenyésztett sejteken végeztük. A HeLa sejteket 70-80% – os összefolyásban tenyésztettük, egyszer PBS-sel mostuk, majd vagy 4% w/v PFA-val 5-7 percig, vagy hideg-metanollal rögzítettük 3-5 percig 4 kb-n.kérjük, vegye figyelembe, hogy mivel a vizsgálatban használt antitestek többsége csak PFA-rögzítéskor működött, a mintákat általában 4% w/v PFA-val rögzítettük PBS-ben, hacsak az ábra jelmagyarázata(I) másként nem említi. A PFA-t a biztonsági előírásoknak megfelelően eldobtuk, és a cellákat háromszor PBS-sel mossuk. A sejteket ezután permeabilizáltuk 0.5% v/v Triton X-100 5-7 percig, majd mossuk háromszor PBS eltávolítani a maradék mosószert. Ezután blokkoló oldatként 1 tömegszázalék testfelszínt tartalmazó oldatot adtunk a fedőlapokra, hogy csökkentsük a primer és szekunder antitestek nem specifikus kötődését, és 1 órán át szobahőmérsékleten tartottuk. A blokkoló oldatot ezután lekapcsolták a fedőlapokról, és a megfelelő hígítás mellett a primer antitesteket a fedőlapokra adták. Az elsődleges antitestekkel ellátott fedőlapokat 4 db C hőmérsékleten inkubáltuk 16-20 órán át nedves, párás kamrában. A fedőlapokat ezután háromszor PBS-sel mossuk, majd 1 órán át szobahőmérsékleten másodlagos antitesteket tartalmazó oldattal inkubáljuk. (Megjegyezzük, hogy a primer és szekunder antitest oldatok a blokkoló pufferben készültek.) A vizsgálathoz használt másodlagos antitestek hígítása 1:400 Volt, 1% W/v BSA oldatban készítve. Végül a fedőlapokat kétszer mostuk PBS-sel és nagy tisztaságú steril vízzel, és üveglemezekre szereltük Pro-Long arany fakulásgátló DAPI rögzítő közeggel (Invitrogen, USA). A fedőlapokat ezután Zeiss LSM880 vagy LSM780 konfokális mikroszkóppal képeztük A 63x olajimmerziós objektív segítségével.

élő sejtes képalkotás

ATG16L1-kiütéses sejteket vetettünk be a MatTek edényekbe (MatTek, Ashland MA USA). Másnap ezeket a sejteket megfelelő plazmiddal transzfektáltuk kísérleti követelmények alapján Mirus Trans-IT 2020 transzfekciós reagens alkalmazásával. A transzfekciót optiMEM közeggel végeztük, a gyártó protokolljának felhasználásával. Ezután 2% – os Triton X-100 törzsoldatot használtunk a plazmamembrán detergens extrakciójára kijelölt koncentráció eléréséhez. Az 1% – os Triton X-100 végső koncentrációja képes a citoszol és a membrán megkötésére. A p62 aggregátumok atg16l1-knockout sejtekben való jelenlétének megerősítésére irányuló kísérlet azonban detergens extrakciót tartalmazott, 1,5% Triton X-100 alkalmazásával, mint végső koncentrációval, hogy a sejteket keményebb extrakciós körülményeknek tegyék ki. A képalkotást ezután az ‘idősor’ modul segítségével hajtották végre egy inkubált Zeiss AxioObserver Z1 mikroszkópon, lsm780 konfokális mikroszkóppal, 63 6,4 na plan apochromat olajimmerziós lencsével.

szuperfelbontású mikroszkópia

a mintákat Zeiss nagy pontosságú, 1,5 170+ vagy -5 6 mm-es, 18 mm-es, 18 mm-es fedőlapokra vetettük. A festést követően a mintákat Pro-Long arany fakulásgátló DAPI rögzítő közegbe (Life Technologies) szereltük, és 3 napig keményedni hagytuk, hogy elérjük az 1,46-os állandó törésmutatót (ri). A mintákat strukturált megvilágítással képeztük az Elyra PS1-en (Carl Zeiss mikroszkópia). A fázisbeállítást követően 405, 488 és 561 nm-es lézervonalakat használtak a gyöngyköteg leképezéséhez, hogy a csatorna-igazítási algoritmus segítségével korrigálják a kromatikus aberrációt. A Z-stackeket a megvilágítási rács 5 fázisában és 5 forgatásában szerezték be, majd a Zen Black Elyra edition szoftver (Carl Zeiss mikroszkópia) segítségével feldolgozták és igazították.

oldható és oldhatatlan frakciók extrahálása

az oldható és oldhatatlan frakciók extrahálását ATG16L1-knockout sejtekből RIPA pufferben végeztük. Röviden, a sejteket egyszer 1x jéghideg PBS-sel megmossuk, majd lekapartuk, lizáltuk 500 MHz-es RIPA pufferben, és címkézett csövekbe gyűjtöttük, amelyeket jégen tartottak. A RIPA puffer összetétele a következő volt:

RIPA puffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% nátrium-dezoxikolát

0.1% SDS

a használat idején a RIPA puffert teljes proteáz inhibitor tablettával (1 tabletta 50 ml-enként) és foszfatáz inhibitor 2-es és 3-as koktélokkal (egyenként 1:100) egészítették ki.

a lizátumokat ezután 10 alkalommal átvezetjük egy 25 G-os tűn, majd az oldatot 14000 rpm-en 15 percen át centrifugáljuk 4 db C-on.centrifugálás után a felülúszót egy friss Eppendorf-csőben összegyűjtöttük, és oldható frakcióként jelöltük, majd 300 db 2x Laemmli pufferrel összekeverjük, és 5 percig forraljuk. A centrifugálás után kapott pellet az oldhatatlan frakcióból áll, majd reszuszpendáljuk, és 500 MHz RIPA pufferrel mossuk. A reszuszpendált oldatot ezután 14000 fordulat / perc sebességgel 5 percen át centrifugáltuk 4 db C-on. a felülúszót eldobtuk, és a pelletet 100 ml karbamid + RIPA pufferben reszuszpendáltuk. Ezt végül 100 db 2x laemmli pufferrel keverték össze, és 5 percig forralták. A karbamid + RIPA puffer összetétele további karbamidból áll, 2 M végső koncentrációban, a RIPA puffer komponenseivel együtt.

Western blot

a 6 lyukú lemezeken tenyésztett sejteket lizáltuk és 2x Laemmli pufferben gyűjtöttük (4% m/v SDS, 20% V/v glicerin, 10% v/v 2-merkaptoetanol, 0,004% m/v brómfenol kék és 125 mM Tris HCl, pH 6,8). Miután a sejteket lizáltuk, 20-30 ml mintát töltöttünk egy 10-kút, 12-15% – os SDS-oldalra, és 100-120 V-on futtattuk. a mintákkal együtt egy standard MW létrát töltöttünk be, hogy nyomon kövessük a fehérjék mozgását a gélben. A fehérjéket ezután átvittük az aktivált PVDF-re 100 V-on 60 percig. A membránt az átadás befejezése után eltávolítottuk, és 5% (m/v) fölözött tejben áztattuk, hogy a nem specifikus kötőhelyeket 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoljuk. Ezután egy specifikus primer antitestet tartalmazó oldatot (amelyet 5% w/v fölözött tejben állítunk elő) megfelelő hígítással adtunk a membránhoz egy éjszakán át tartó inkubáláshoz 4 6c-n. a membránokat ezután háromszor mossuk pbst-vel (Foszfátpuffer sóoldat +0,1% Tween-20) a másodlagos antitest hozzáadása előtt. A másodlagos antitestet, amelyet szintén 5% w/v fölözött tejben állítottunk elő, a membránnal 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A másodlagos antitest hígítását a fokozott kemilumineszcencia (ECL) HRP-konjugált antitestek esetében általában 1:4000-nél, a LICOR-fluorofor-konjugált antitestek esetében pedig 1:5000-nél tartottuk. A membránokat ezután többször PBST-vel ismét megmossuk, majd egyenlő mennyiségű ECL 1-es és 2-es fejlesztőoldat keverékével fejlesztettük ki, vagy közvetlenül a fluoreszcencia jel detektálására képeztük LICOR Image Studio szoftverrel (LICOR, USA).

CRISPR knockout cellageneráció

az útmutató RNS-eket ATG9 knockout cellák generálására tervezték a Zhang Lab21 által kifejlesztett online eszköz segítségével. Az első három single guide RNS (sgrns) találatot manuálisan módosították, hogy BbsI restrikciós helyeket adjanak hozzá, és ezeket a sótalan tisztaságú sgrns szekvenciákat az Invitrogen rendelte. Az ATG9 CRISPR kiütéshez sikeresen alkalmazott szekvencia a következő volt:

a kiemelt nukleotidok jelzik a hozzáadott túlnyúlásokat. Az sgrns-t ezután a psCas9-2a-puromicin gerincben ligáltuk. A sikeresen ligált plazmidokat vagy az üres Cas9 vektor kontrollt ezután transzfektáltuk HeLa sejtekben, és az expressziót 24 órán át hagytuk. A transzfektált sejteket ezután úgy választottuk ki, hogy puromicint adtunk a sejtekhez 2-4-4G/ml végső koncentrációban. A sejteket addig hagyták növekedni, amíg az összes nem transzfektált sejt el nem pusztult. A pozitív sejteket ezután tripszinizáltuk, és a sejtszámot Invitrogen Countess-diák segítségével értékeltük (10 db homogén sejtszuszpenzió +10 db ~ tripánkék). Az élő sejtpopuláció alapján 0,2 604 sejtet szívtunk be, majd egy 96 lyukú lemezen sorozatosan hígítottunk, hogy egysejtű kolóniákat kapjunk. A Soros hígítás mindig az volt 1:1 és a hígítás végén a végső térfogatot minden egyes kútban 200 MHz-en tartottuk. A sejtlizátumokat ezután az SDS-oldalra töltöttük, átvisszük egy membránra, hogy ellenőrizzük az ATG9 kiütését.

adatok számszerűsítése és statisztikai elemzés

a képeket az ImageJ alapértelmezett ‘elemezze a részecskéket’ plugin segítségével számszerűsítettük. Ezenkívül a co-localized pixeleket azonosították, és egy profilt hoztak létre egy felügyelet nélküli ImageJ plugin algoritmus segítségével, amelyet ‘colocalization’ – nek hívtak, amelyet Pierre Bourdoncle fejlesztett ki (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). A western blot-okat a LICOR Image Studio szoftver (LICOR, USA) segítségével számszerűsítettük, és az értékeket a Microsoft Office programcsomag Excel programjával dolgoztuk fel, elemeztük és ábrázoltuk.

a két csoport összehasonlításának statisztikai szignifikancia szintjeit egy-vagy Kétfarkú t-tesztekkel becsülték meg. Az ATG7-et és ATG10 KD-t magában foglaló kísérlethez egyfarkú t-tesztet használtunk az adatok statisztikai szignifikanciájának felmérésére. A vizsgálat összes többi kísérletéhez Kétfarkú t-tesztet használtunk az adatok statisztikai szignifikanciájának felmérésére. Ebben a tanulmányban a P < 0,05 értékét statisztikailag szignifikánsnak tekintették, és az eredmények ábrázolására használt konvenciók ebben a cikkben a következők: *p 0,05; **p 0,01; ***p 0,001, a hibasávok pedig szórásokat jelentenek, hacsak másként nem említjük.