Calmodulin
calmodulin kölcsönhatások Ca2+ és NOS
a CaM egy kis Ca2+-kötő fehérje (molekulatömege 17 kDa), amely két hasonló gömbölyű lebenyből áll, amelyeket egy központi linker régió köt össze. Mindegyik lebeny két E – F kezet tartalmaz, amelyek tartalmaznak egy N-terminális hélixet (E hélix), egy központi elhelyezkedésű Ca2+ koordináló hurkot és egy C-terminális hélixet (F hélix) (a CaM doménjeit általában 1-4-nek jelölik N-től C-ig terminál). Ca2 + kötéskor a CaM képes több mint 30 célenzimhez kötődni és aktiválni, lehetővé téve számos második hírvivő és sejtfunkció szabályozását. A célfehérjék CaM általi megkötése és teljes aktiválása általában megköveteli a CaM mind a négy Ca2 + – kötő helyének elfoglalását. A karboxi-terminális lebeny két nagy affinitású CA-t tartalmaz2+-kötő helyek, míg az amino-terminális lebeny két alacsonyabb CA-val rendelkező helyet tartalmaz2+ affinitás. Konformációs változások történnek a CaM-ban, miután megköti a Ca-T2+: a hidrofób felületi maradékok ki vannak téve annak érdekében, hogy kritikus van der Waals kölcsönhatásokat alakítsanak ki a cél peptidfelismerő hely hidrofób felületével.
a CaM az egyes NOS alegységekhez 1:1 sztöchiometriával kötődik, ésszerűen nagy affinitással. A NOS CaM felismerési szekvenciáknak megfelelő peptidekkel végzett kötési affinitási vizsgálatok azt mutatják, hogy a három NOSs különböző affinitást mutat a CaM felé, az általános rend pedig citokin-indukálható NOS (iNOS)!!!!!!!!!!!. Az iNOS peptid jól kötődik a CaM-hez Ca jelenlétében és hiányában IS2+, de az eNOS és nNOS peptidek csak Ca jelenlétében kötődnek a CaM-hoz2+.
a CaM minden egyes lebenye önállóan kötődik a NOS–hoz, és különböző affinitást mutat a NOS felé. a CaM-nNOS kölcsönhatást CaM mutánsok és növényi CaM fehérjék felhasználásával vizsgálták. az nNOS magas fokú szerkezeti specifitást mutat az 1., 3. és esetleg 4. CaM doménekkel szemben a hem redukció aktiválása és a szintézis hiánya tekintetében. A CaM-nNOS kölcsönhatások különösen fontosak az elektrontranszfer szempontjából, és magukban foglalják a CaM retesz régióját (amelyet a CaM domének alkotnak 1 és 3) és a metionin maradékot a 4 doménben. Úgy tűnik, hogy a CaM ezen régiói kölcsönhatásba lépnek az NNO-k még ismeretlen régióival, amelyek különböznek kanonikus CaM-kötési sorrendjétől. A központi linker töltése és hossza szintén befolyásolja az iNOS kötődését és aktiválódását a központi linker elektrosztatikus kölcsönhatása és a CAM globuláris doménjének hidrofób kölcsönhatásai révén, amely felelősnek tűnik az iNOS-hoz való szoros kapcsolatáért. Ca2 + a NOS-hoz kötött CaM-tól való disszociáció két egymást követő lépésben történik: először gyors Ca2+ disszociáció következik be az N-terminális lebenyből, amely megfelel a NO szintézis inaktiválásának, majd lassabb Ca2+ disszociáció következik be a C-terminális lebenyből, ami a CaM disszociációjához vezet a NOS-ból. Konformációs változások történnek a NOS CaM-kötő peptidekben, amikor megkötik a CaM-ot. Jellemzően a peptidek a CA-val való kölcsönhatás során megszerzik az a-T! \ T2+ kötött CaM. A NOS reduktáz domén CaM-indukálta konformációs változása is bekövetkezik, amit a fehérje és a flavin fluoreszcencia változása, valamint a tripszin proteolízis mintázatának megváltozása jelez.
rendelkezésre áll a Ca2+terhelésű CaM kristálytani szerkezete, amely az eNOS CaM felismerési szekvenciának megfelelő 20 maradék peptidhez kötődik. A szerkezet feltárta, hogy a Homo-spirális eNOS peptid antiparallel orientációban kötődik a CaM-hez kiterjedt hidrofób kölcsönhatások révén: a CAM N-terminális és C – terminális lebenyei körbeveszik a kötött peptidet, kölcsönhatásba lépve a peptid C-és N-terminális felével. A retesz régióban és a 4.doménben található specifikus CaM-maradványokat a mutagenezis vizsgálatok által meghatározott fontosságuknak megfelelő módon helyeztük el. A kristályszerkezet a szigorúbb Bütyökkötés alapját is javasolta az iNOS-ban: mivel az iNOS nagyobb számú hidrofób maradékot tartalmaz a megfelelő CaM-felismerési szekvencián belül, azzal érveltek, hogy ezek támogatnák a kiterjedtebb van der Waals-érintkezést a CaM-kel, és minimalizálnák a hidrofób maradványok kedvezőtlen oldószeres expozícióját annak érdekében, hogy elősegítsék a CAM és az iNOS CaM-felismerési szekvencia közötti szorosabb kapcsolatot.
a Ca2+/CaM és az emberi iNOS FMN doménje közötti komplex kristályszerkezete is rendelkezésre áll. A komplex szerkezetében négy különböző konformációt azonosítottak, ami jól mutatja A CaM és az FMN tartomány-tartomány kölcsönhatások rugalmasságát. A CAM és az FMN domén között kialakított sóhíd látható a szerkezetben, és fontos lehet a CAM kötés NOS funkciókra gyakorolt hatásának transzdukciójában.