Caratterizzazione della mucosa aggregati linfoidi nella colite ulcerosa: immune fenotipo delle cellule e del TcR-γδ espressione | Gut

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LEUCOCITI COSTITUISCONO LA PRINCIPALE TIPO di CELLULA INFIAMMATO UC COLON E DISTRIBUIRE in modo DIVERSO NELLA MUCOSA del COLON DI UC PAZIENTI RISPETTO ai CONTROLLI

Dodici campioni di infiammata sigma UC pazienti e 15 campioni di apparentemente normale colon sigmoideo da pazienti senza storia di malattia infiammatoria cronica intestinale sono stati sottoposti ad analisi fenotipica di immunoistochimica. Nove di questi campioni UC sono stati classificati come gravemente malati. In questi l’epitelio era appiattito con un numero ridotto di cellule caliciformi, cripte ramificate e ulcerazioni occasionali. Gli ascessi della cripta erano comuni. La lamina propria conteneva numerosi leucociti sparsi e aggregati linfoidi basali (fig 1A). Tre campioni di UC sono stati classificati come moderatamente malati. In tutto l’epitelio era intatto con un numero leggermente ridotto di cellule caliciformi e non/poche cripte ramificate. La lamina propria conteneva un aumento del numero di leucociti ed erano presenti aggregati linfoidi. L’analisi morfometrica è stata focalizzata sugli aggregati.

Gli aggregati comprendevano cluster nodulari di linfociti senza centri reattivi tipici. Si trovavano tra le basi delle cripte e la sottomucosa senza apparente contatto con l’epitelio luminale (fig 1A). Tuttavia, è stata spesso notata una stretta vicinanza tra le cellule negli aggregati e l’epitelio della cripta (fig 1A, D). La frequenza degli aggregati (numero/area) è stata simile nei tessuti moderatamente e gravemente malati, da 1,3 a 4,9 aggregati per mm2 di lamina propria (tabella 3). Tuttavia, l’area della lamina propria occupata dagli aggregati aumentava con la gravità della malattia e costituiva fino al 45% della lamina propria nel colon gravemente malato da alcuni pazienti (tabella 3). I follicoli solitari normali nel colon di controllo erano rari (meno di 0,1 follicolo/mm2 di lamina propria, n=8).

Circa il 75% delle cellule in aggregati sono stati leucociti (74 (7)% cellule CD45+ (n = 9)). Anche la percentuale di leucociti nei follicoli linfoidi solitari era elevata (67 (6) % cellule CD45+(n=8)). Entrambi i valori possono essere sottovalutati in quanto la colorazione con anti-CD45 mAb era eterogenea. Questa colorazione eterogenea può essere spiegata, almeno in parte, dalla diminuzione dell’espressione di CD45 sulle cellule B attivate.

Il numero di leucociti sia nella lamina propria al di fuori degli aggregati (26 (7)% cellule CD45+ (n=4)) e nella sottomucosa (8 (2)% di cellule CD45+ (n=4)) è stato aumentato in UC due punti rispetto al normale colon (15 (2)% di cellule CD45+ nella lamina propria al di fuori dei follicoli e 4 (2)% di cellule CD45+nella sottomucosa (n=4)).

I leucociti intraepiteliali erano presenti a frequenze più basse nel colon UC rispetto al colon normale: 28 (7) Cellule CD45+/1000 cellule epiteliali nel tessuto del colon gravemente malato (n=4) rispetto a 66 (26) cellule CD45+/1000 cellule epiteliali nei controlli (n=4, p=0,03). IEL sono stati rilevati principalmente all’interno dell’epitelio criptale nel colon UC, in parte a causa di erosioni dell’epitelio della superficie luminale. Nel colon normale, > 60% di IEL erano localizzati nell’epitelio luminale. Pertanto, poiché la densità di IEL è inferiore nell’epitelio criptale rispetto all’epitelio luminale nel colon normale, la frequenza più bassa di IEL nel colon UC può essere spiegata dal fatto che il colon UC contiene principalmente epitelio criptale.

GLI AGGREGATI NEL TESSUTO DEL COLON DEI PAZIENTI CON UC COMPRENDONO QUASI ESCLUSIVAMENTE LINFOCITI T E B

Gli aggregati sono stati analizzati per la presenza dei tre principali tipi di linfociti: cellule T (MAB anti-CD3), cellule B (una miscela di MAB anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD22) e cellule NK. Per l’analisi delle cellule NK, è stato scelto anti-CD57 mAb poiché abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule αβ e γδ T che esprimono il classico marcatore cellulare NK CD56 sono presenti nell’intestino umano.25 Anti-CD15 è stato utilizzato per rilevare granulociti, anti-CD14 per monociti del sangue / macrofagi recentemente reclutati e anti-CD68 per macrofagi tissutali. Per rilevare le cellule dendritiche follicolari (FDC), sono stati utilizzati tre diversi MAB (tabella 2). Anti-CD80 / B7.1 è stato utilizzato per rilevare cellule con funzione di presentazione dell’antigene e anti-CD1a è stato utilizzato come marcatore aggiuntivo per le cellule dendritiche/Langerhans. I risultati dell’analisi immunomorfometrica sono riassunti in fig 3. I due principali tipi di cellule erano le cellule T e B e la somma delle cellule CD3 + e CD19/20/22+le cellule hanno eguagliato il numero di cellule CD45+ nella maggior parte dei campioni (77 (12)% rispetto a 74 (7) % cellule CD45+ (n=9)). Le cellule T e B costituivano proporzioni altrettanto grandi delle cellule negli aggregati. Gli aggregati contenevano grandi aree di cellule T senza cellule B e aree reciproche dominate da cellule B con solo poche cellule T sparse (fig 2A, B). La maggior parte degli aggregati consisteva di cellule densamente imballate, ma in alcuni casi sono state rilevate aree limitate di cellule più vagamente imballate nella zona delle cellule B. La proporzione di cellule B era significativamente più alta negli aggregati di colon UC gravemente malato rispetto al tessuto moderatamente malato (43 (8)v 30 (6); p=0,03), suggerendo una maggiore importanza delle cellule B nelle forme gravi della malattia. I follicoli solitari nel colon normale avevano un aspetto leggermente diverso. Il centro del follicolo conteneva grandi cellule B vagamente imballate con poche o nessuna cellule T, circondate da una zona di entrambe le cellule B e T e aree nella periferia che contenevano solo cellule T (fig 2D, E).

Le cellule dendritiche follicolari sono state rilevate in sette dei nove campioni UC utilizzando tre diversi MAB anti-FDC. Non è stata osservata alcuna differenza nei modelli di colorazione tra i tre MAB. Le cellule dendritiche follicolari colorate positivamente formavano una rete che si trovava nell’area delle cellule B degli aggregati (fig 2B, C). Sebbene ogni aggregato contenesse almeno un’area di cellule B, solo circa il 40% conteneva una rete FDC. Le reti FDC non sono mai state viste nelle aree delle cellule T. Nel colon normale ogni follicolo conteneva una rete FDC che era confinata all’area delle cellule B (fig 2E, F). CD80 / B7.1 + cellule dendritiche erano presenti anche negli aggregati di UC colon. Sono stati più comunemente visti come singole cellule dendritiche circondate da piccoli punti CD80 + tra i linfociti, presumibilmente sezioni trasversali di protrusioni dendritiche. Occasionalmente si poteva vedere una rete completa di celle CD80+ (fig 1E). Questa rete era situata in un’area di cellule T. Negli aggregati non sono state rilevate cellule CD1a+ con morfologia dendritica.

Sebbene la percentuale di granulociti, cellule CD15+, fosse elevata nella maggior parte dei campioni UC, tali cellule erano generalmente situate al di fuori degli aggregati (fig 3). Numerosi macrofagi tissutali, cellule CD68+, erano presenti nella lamina propria al di fuori degli aggregati. Negli aggregati erano scarsi e situati nell’orlo esterno (fig 3). Nel colon normale, la maggior parte delle cellule CD68 + sono state localizzate in prossimità dell’epitelio luminale.29 Aggregati con un numero significativo di cellule CD14+ sono stati osservati solo in due campioni. Questi campioni avevano anche un’alta frequenza di cellule CD14+nella sottomucosa (cioè ≈3,5% cellule CD14+ rispetto a ≈1% cellule CD14+ in altri campioni UC colon e colon di controllo). Inoltre, le cellule CD14 + erano concentrate vicino ai vasi sanguigni, suggerendo l’invasione in corso dei monociti. Non c’era alcun parametro clinico ovvio che potesse spiegare perché si fosse verificata l’invasione dei monociti, in particolare in questi due campioni. Le cellule NK, le cellule CD57+, erano rare sia nel tessuto UC che nel colon normale e sono state rilevate solo occasionalmente negli aggregati (fig3).

Gli aggregati linfoidi nel colon UC non differivano significativamente dai follicoli solitari nel colon normale per quanto riguarda il numero di cellule T, cellule B, macrofagi/monociti, granulociti e cellule NK (fig 3). Inoltre, una rete FDC situata nella zona delle cellule B è stata osservata in entrambi i tipi di strutture. Tuttavia, gli aggregati mancavano di una tipica zona di cellule B germinali simili al centro con cellule B vagamente imballate che si osserva nei normali follicoli solitari. Inoltre, gli aggregati in UC colon occupavano fino al 45% della lamina propria.

GLI AGGREGATI NEL COLON UC SONO COLONIZZATI DA CELLULE γδ T

Un numero sorprendentemente elevato di cellule negli aggregati erano cellule γδ T (11 (7%) cellule TcR-γδ+ (n=9)) (fig 1B,3). Al contrario, quasi nessuna cellula γδ T è stata rilevata nei follicoli del colon normale (0,3 (0.3) % cellule TcR-γδ+ (n=8) (p<0,001)) (fig 3). Il numero di cellule TCR-γδ + negli aggregati è aumentato con la gravità della malattia. Il rapporto tra cellule TcR-αβ + e cellule TcR-γδ + negli aggregati era 2,4 (0,9) nei campioni UC gravemente malati (n=6) ma variava da 1,3 a 42 nei campioni moderatamente malati (n=3) ed era >300 nei follicoli colon normali. In cinque campioni sono state determinate le frequenze delle cellule γδ T sia negli aggregati che nella lamina propria al di fuori degli aggregati. Negli aggregati, la frequenza delle cellule TcR-γδ+ era 3,9 (2.5) volte superiore rispetto all’esterno degli aggregati. Le cellule TcR-γδ + negli aggregati esprimevano principalmente Vδ1 mentre la maggior parte delle cellule che utilizzavano Vδ2 sono state trovate al di fuori degli aggregati. La frazione LPL totale è stata analizzata per l’utilizzo del gene Vδ mediante citometria immunoflow su cellule isolate. In accordo con i risultati immunoistochimici, l ‘ 86 (10)% delle cellule TcR-γδ+ha espresso Vδ1 mentre le restanti cellule hanno espresso Vδ2 (table4). In linea con l’analisi ultrastrutturale delle cellule γδ+ T (vedi sotto), la colorazione delle cellule TCR-γδ+ha spesso mostrato un aspetto irregolare o maculato sull’immunoistochimica (fig 1B, inserto) e ha mostrato un’intensità di fluorescenza relativamente bassa nella citometria immunoflow (fig 4). A causa del modello di colorazione eterogeneo per TcR-γδ, il numero di cellule γδ+ T può essere sottovalutato. L’analisi di citometria immunoflow bicolore di LPL isolato ha mostrato che quasi tutte le cellule γδ+ T esprimevano CD45R0. Fino al 15% delle cellule γδ+ T espresse CD8, ma la maggior parte delle cellule γδ+ T erano CD4/CD8 doppio negativo.

CD4+CD28−αβ CELLULE T COSTITUISCONO LA PRINCIPALE delle CELLULE T SOTTOTIPO degli AGGREGATI

La maggior parte delle cellule T in aggregati espressi TcR-αβ e la percentuale di cellule CD4+ è superiore alla percentuale di cellule CD8+ (fig 3) con una media di rapporto CD4/CD8 di 1,7 (0.7) (n = 8). La dominanza delle cellule CD4 + è stata ancora più pronunciata quando sono stati analizzati LPL isolati (fig 4). L’analisi della citometria immunoflow bicolore di LPL ha mostrato che quasi tutte le cellule CD4 + esprimevano TcR-αβ (dati non mostrati). Le cellule CD8+ sono state trovate solo nell’area delle cellule T degli aggregati mentre le cellule CD4+ erano presenti sia nell’area delle cellule T che sparse nell’area delle cellule B. In diversi campioni la somma delle cellule CD4+ e CD8 + ha superato il numero di cellule CD3 + e / o cellule TcR+. Ciò probabilmente riflette la sottostima delle cellule T a causa dell’espressione a basso livello del complesso CD3/TcR piuttosto che della presenza di cellule doppie positive CD4/CD8 in quanto solo il 2,4 (1,3)% (n=4) della LPL totale era doppio positivo nell’analisi della citometria immunoflow (fig 4). Sebbene numerose cellule che esprimono il co-recettore CD28 delle cellule T fossero sparse in lamina propria al di fuori degli aggregati (13 (2)% cellule CD28+ (n=3)), non sono state rilevate cellule CD28+ negli aggregati (tabella 5; fig 1D).

non C’erano differenze significative nelle frequenze e fenotipi di αβ sottoinsiemi di cellule T tra aggregati in UC colon e solitario follicoli nel controllo del colon (fig 3).

LA MAGGIOR PARTE DELLE CELLULE B NEGLI AGGREGATI ESPRIME IgM SULLA LORO SUPERFICIE

La maggior parte delle cellule nell’area delle cellule B degli aggregati ha mostrato colorazione da anti-IgM MAB (42 (5)% cellule IgM+ (n=4)) corrispondente al 95 (7)% del CD19/20/22+ cellule. Tuttavia, non meno del 19 (2)% delle cellule negli aggregati espressi IgA e una piccola frazione di cellule IgG+ (3,3 (0,4) % (n=4)) sono stati rilevati. Questi dati suggeriscono che le cellule B negli aggregati esprimono più di un isotipo di immunoglobulina e possono essere state recentemente sottoposte a commutazione di classe. Nessuna cellula Ig + ha mostrato una colorazione citoplasmatica, indicando che le plasmacellule non erano presenti negli aggregati. Al contrario, le plasmacellule sono state trovate al di fuori degli aggregati.

Cellule IgM+ (28 (2)% (n=4)) in inferiorità numerica cellule IgA+(14 (1)% (n=4)) e cellule IgG+ (2,2 (0,4)% (n=4)) nei follicoli del colon di controllo. Tuttavia, la somma delle celle Ig + ha eguagliato il numero di CD19/20/22+ cellule in singoli campioni. Più interessante, sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa nel numero di cellule B nei follicoli rispetto agli aggregati (fig 3), la proporzione di cellule IgM+superficiali, cellule IgA+ superficiali e cellule IgG+superficiali era significativamente più alta negli aggregati del colon UC rispetto ai follicoli del colon di controllo (p<0,01 per tutti e tre gli isotipi).

ESPRESSIONE DI MARCATORI NON RISTRETTI DEL SOTTOTIPO NEGLI AGGREGATI LINFOIDI DEL COLON UC

Circa il 50% delle cellule negli aggregati linfoidi ha espresso il marcatore di memoria/attivazione CD45R0 (tabella 5). Inoltre, l’analisi della LPL isolata ha mostrato che le cellule che esprimono CD45R0 e CD45RA costituivano ciascuna circa il 50% della popolazione (n=4). La maggior parte delle cellule CD3 + esprimeva CD45R0 ma era presente anche una frazione significativa di CD45RA che esprimeva cellule CD3 + (fig 4). La maggior parte delle cellule che esprimono CD45R0 erano cellule T e il 20-40% delle cellule CD45R0+ erano cellule B. In due campioni la somma delle cellule che esprimono CD45R0 e CD45RA ha superato il 100%, suggerendo che le cellule che esprimono entrambe le varianti di giunzione possono essere presenti simultaneamente.

La maggior parte delle cellule che esprimono MHC di classe II si trovava nell’area delle cellule B, ma sono state osservate cellule positive MHC di classe II sparse nell’area delle cellule T (dati non mostrati). La percentuale di cellule che esprimono HLA-DR era di circa il 50% (tabella 5). In cinque campioni il numero di cellule HLA-DR + ha superato il numero di cellule B, indicando che alcune cellule T negli aggregati (31-89% delle cellule CD3+in questi singoli campioni) esprimono anche HLA-DR. Risultati simili sono stati ottenuti con tre campioni analizzati per l’espressione HLA-DQ (tabella5).

È interessante notare che l’integrina aEß7, che è presente su un gran numero di IEL nell’intestino normale, è stata espressa su 26 (13)% delle cellule negli aggregati (fig 1C, tabella 5). Le cellule positive hanno mostrato una distribuzione eterogenea, con alcune aree con molte cellule positive e altre aree con poche cellule positive. Le cellule aEexpressing hanno mostrato variazioni nell’intensità della colorazione (fig1C).

Un terzo dei linfociti negli aggregati ha espresso la proteina antiapoptotica bcl-2 (fig 1F, tabella 5). Le cellule che esprimono Bcl-2 erano sparse sull’intero aggregato. Nei normali follicoli solitari è stato osservato circa il 10% delle cellule positive a bcl-2. Erano tutti localizzati nella zona delle cellule B.

L’ANALISI ULTRASTRUTTURALE DELLE CELLULE T γδ NEL COLON UC MOSTRA L’INTERNALIZZAZIONE E LA DOWNREGOLAZIONE SUPERFICIALE DEL TcR-γδ

L’indagine di microscopia immunoelettronica si è concentrata sulle cellule T γδ nel colon UC. Per scopi comparativi abbiamo anche analizzato le cellule T γδ nella mucosa del colon normale. TcR-γδ è stato rilevato come depositi del prodotto di reazione denso di elettroni.

Nel colon normale, il prodotto di reazione è stato distribuito omogeneamente sulla superficie cellulare di tutte le cellule γδ T trovate, sia su quelle situate nella lamina propria (fig 5A) che sulle cellule γδ T intraepiteliali (fig 5B).

Al contrario, le cellule T γδ nel colon UC hanno mostrato un’estrema variabilità nella distribuzione del prodotto di reazione dalla superficie cellulare al citoplasma. Abbiamo identificato cinque tipi di modelli di colorazione (cinque morfotipi). le cellule γδ T del primo tipo (fig 6A) hanno mostrato una distribuzione eterogenea del prodotto di reazione sulla superficie cellulare. Alcuni esibivano singoli corpi multivesicolari colorati positivamente. Nelle cellule γδ T del secondo tipo, il prodotto di reazione è stato visto come scarsi cluster lineari distribuiti più o meno casualmente sulla superficie cellulare (fig 6B). Inoltre, alcuni depositi raggruppati sono stati localizzati sopra e all’interno di invaginazioni superficiali che variavano da fosse poco profonde a invaginazioni più profonde a forma di pallone (fig 6B, inserto). Non è stato possibile utilizzare controcolorazione aggiuntiva. Pertanto, sebbene alcune delle invaginazioni superficiali assomigliassero a fosse rivestite, non potevamo determinare se queste invaginazioni fossero rivestite o meno. Nelle cellule γδ T del terzo tipo il prodotto di reazione era localizzato come cluster di superficie cellulare e anche nei vacuoli citoplasmatici con caratteristiche morfologiche degli endosomi (fig 6C). Nelle cellule γδ T del quarto tipo il prodotto di reazione era abbondantemente presente nel citoplasma ma appena rilevabile sulla superficie cellulare (fig 6D, E, F). Il prodotto di reazione ha macchiato numerose vescicole citoplasmatiche e vacuoli vicino alla membrana cellulare e anche in profondità nelle cellule vicine al nucleo. Le vescicole colorate positivamente sono state talvolta osservate in continuità con la membrana plasmatica e assomigliavano a vescicole rivestite (fig 6E). Sono stati colorati anche numerosi corpi multivesicolari costituiti da microvescicole ben imballate (fig 6F). le cellule T γδ del quinto tipo erano rare (fig 6G, H). Questo morfotipo di solito mostrava una forte colorazione positiva della membrana plasmatica e dello spazio perinucleare. A volte il prodotto di reazione ha macchiato diversi vacuoli citoplasmatici di diverse dimensioni e forme. Non è stata osservata alcuna differenza evidente tra i singoli campioni del colon UC studiati.

In sintesi, la maggior parte delle cellule T γδ (morfotipi 1-4) nel colon UC ha mostrato la localizzazione cellulare del prodotto di reazione molto probabilmente riflettendo i diversi passaggi consecutivi dell’internalizzazione del TcR: formazione di cluster, fosse rivestite, vescicole rivestite, endosomi e corpi multivesicolari.30 Un piccolo numero di cellule (morfotipo 5) ha mostrato sintesi attiva di molecole TCR-γδ.