Karakterisering av mukosale lymfoide aggregater i ulcerøs kolitt: immuncellefenotype Og tcr-γδ expression | gut

Resultater

LEUKOCYTTER UTGJØR HOVEDCELLETYPEN I INFLAMMET UC-KOLON OG FORDELER SEG FORSKJELLIG I KOLONSLIMHINNEN HOS UC-PASIENTER SAMMENLIGNET MED KONTROLLER

tolv Prøver av inflammet sigmoid-kolon FRA uc-PASIENTER og 15 prøver av tilsynelatende normalt sigmoid-kolon fra pasienter uten tidligere ibd ble utsatt FOR fenotypisk analyse ved immunhistokjemi. Ni AV DISSE UC-prøvene ble klassifisert som alvorlig syke. I disse epitelet ble flatet med redusert antall beger celler, forgrenede krypter, og sporadiske sår. Crypt abscesser var vanlig. Lamina propria inneholdt mange spredte leukocytter så vel som basale lymfoide aggregater (fig 1A). Tre UC-prøver ble klassifisert som moderat syke. I hele epitelet var intakt med litt redusert antall bobelceller og ingen / få forgrenede krypter. Lamina propria inneholdt økt antall leukocytter og lymfoide aggregater var til stede. Den morfometriske analysen ble fokusert på aggregatene.

aggregatene besto av nodulære sammenslåingsklynger av lymfocytter uten typiske reaktive sentre. De var plassert mellom kryptens baser og submukosa uten tilsynelatende kontakt med luminalepitelet (fig 1A). Imidlertid ble nærhet mellom celler i aggregatene og kryptepitelet ofte notert (fig 1A, D). Frekvensen av aggregater (antall/område) var lik i moderat og alvorlig sykt vev, fra 1,3 til 4,9 aggregater per mm2 lamina propria(tabell 3). Imidlertid økte arealet av lamina propria okkupert av aggregatene med alvorlighetsgraden av sykdommen og utgjorde så mye som 45% av lamina propria i alvorlig syk kolon fra noen pasienter(tabell 3). Normale ensomme follikler i kontrollkolon var sjeldne (mindre enn 0,1 follikler / mm2 av lamina propria, n = 8).

omtrent 75% av cellene i aggregatene var leukocytter (74 (7)% CD45+ celler (n = 9)). Andelen leukocytter i enslige lymfoide follikler var også høy (67 (6) % CD45 + celler(n = 8)). Begge verdiene kan undervurderes da farging med ANTI-CD45 mAb var heterogen. Denne heterogene fargingen kan forklares, i det minste delvis, ved redusert ekspresjon AV CD45 på aktiverte b-celler.

antall leukocytter både i lamina propria utenfor aggregatene (26 (7)% CD45+ celler (n=4)) og i submukosa (8 (2)% CD45+ celler (n=4)) var økt I UC kolon sammenlignet med normalt kolon (15 (2) % CD45 + celler i lamina propria utenfor folliklene og 4 (2)% CD45+celler i submukosa (n=4)).

Intraepiteliale leukocytter var tilstede i lavere frekvenser I UC-kolon sammenlignet med normalt kolon: 28 (7) CD45 + celler/1000 epitelceller i alvorlig sykt kolonvev (n=4) sammenlignet med 66 (26) CD45+ celler/1000 epitelceller i kontroller (n=4, p=0,03). IEL ble hovedsakelig påvist i kryptalepitelet I UC-kolon, delvis på grunn av erosjoner i luminal overflateepitel. I normal kolon var > 60% av IEL lokalisert i luminalepitelet. Således som tettheten av IEL er lavere i kryptal enn i luminal epitel i normal kolon den lavere frekvensen av IEL I UC kolon kan forklares ved DET faktum AT UC kolon inneholder hovedsakelig kryptisk epitel.

AGGREGATER I KOLONVEV HOS UC-PASIENTER UTGJØR NESTEN UTELUKKENDE T-OG B-LYMFOCYTTER

Aggregater ble analysert for tilstedeværelsen av de tre hovedtyper lymfocytter: T-celler( anti-CD3 mAb), B-celler (en blanding av ANTI-CD19, ANTI-CD20 og ANTI-CD22 mAbs) og NK-celler. For analyse av NK-celler ble anti-CD57 mAb valgt da vi tidligere har vist at αβ og γδ t-celler Som Uttrykker den klassiske nk-CELLEMARKØREN cd56, FINNES I human tarm.25 Anti-CD15 ble brukt til å påvise granulocytter, anti-CD14 for blodmonocytter / nylig rekrutterte makrofager og anti-CD68 for vevsmakrofager. For å oppdage follikulære dendrittiske celler (FDC) ble tre forskjellige mAbs brukt (tabell 2). Anti-CD80 / B7.1 ble brukt til å detektere celler med antigenpresenteringsfunksjon og anti-CD1a ble brukt som en ekstra markør for dendritiske/Langerhans-celler. Resultatene av den immunomorfometriske analysen er oppsummert i fig 3. De to viktigste celletypene var T-og B-celler og summen AV CD3 + – celler OG CD19/20/22+celler utgjorde ANTALL CD45 + celler i de fleste prøver (77 (12)% sammenlignet med 74 (7)% CD45+ celler (n=9)). T-og B-celler utgjorde like store andeler av cellene i aggregatene. Aggregatene inneholdt store t-celleområder uten B-celler og gjensidige områder dominert Av B-celler med bare noen få spredte T-celler (figur 2a, B). De fleste aggregater besto av tettpakkede celler, men i noen tilfeller ble begrensede områder av mer løst pakkede celler detektert i b-cellesonen. Andelen B-celler var signifikant høyere i aggregater av alvorlig sykt UC-kolon sammenlignet med moderat sykt vev (43 (8) v 30 (6); p=0,03), noe som tyder på økt betydning Av B-celler i alvorlige sykdomsformer. Solitære follikler i normal kolon hadde et litt annet utseende. Sentrum av follikkelen inneholdt løst pakket store b-celler med få, Om Noen, T-celler, omgitt av en sone av Både B-og T-celler og områder i periferien som bare inneholdt T-celler (fig 2d, E).

Follikulære dendrittiske celler ble påvist i syv av ni uc-prøver ved bruk av tre forskjellige anti-FDC mAbs. Ingen forskjell i fargemønstre ble sett mellom de tre mAbs. De positivt fargede follikulære dendritiske cellene dannet et nettverk som befant Seg I B-celleområdet av aggregatene(figur 2b, C). Selv om hvert aggregat inneholdt minst Ett b-celleområde, inneholdt bare om lag 40% ET FDC-nettverk. FDC-nettverk ble aldri sett I T-celleområder. I normal kolon inneholdt hver follikkel ET fdc-nettverk som var begrenset Til b-celleområdet (fig 2E, F). CD80 / B7.1 + dendritiske celler var også tilstede i aggregatene AV UC-kolon. De ble oftest sett på som enkle dendritiske celler omgitt av små CD80 + prikker mellom lymfocytter, antagelig tverrsnitt av dendritiske fremspring. Av og til kan et komplett nettverk AV CD80+ – celler ses (fig 1E). Dette nettverket var plassert i Et t-celleområde. Ingen CD1a + – celler med dendritisk morfologi ble påvist i aggregatene.

selv om andelen granulocytter, CD15 + – celler, ble forhøyet i de fleste UC-prøver, var slike celler generelt plassert utenfor aggregatene(fig 3). Tallrike vevsmakrofager, CD68 + – celler, var tilstede i lamina propria utenfor aggregatene. I aggregatene var de knappe og plassert i ytre kant(figur 3). I normal kolon ble DE FLESTE CD68+ – celler lokalisert i nærheten av luminalepitelet.29 Aggregater med betydelig ANTALL CD14 + – celler ble sett i bare to prøver. Disse prøvene hadde også en høy frekvens AV CD14 + – celler i submukosa(det vil si ≈3,5% CD14 + – celler sammenlignet med ≈1% CD14 + – celler i andre UC-kolonprøver og kontrollkolon). VIDERE BLE CD14 + – celler konsentrert nær blodkar, noe som tyder på pågående invasjon av monocytter. Det var ingen åpenbar klinisk parameter som kunne forklare hvorfor monocyttinvasjon hadde skjedd, spesielt i disse to prøvene. NK-celler, CD57 + – celler, var sjeldne både I UC og normalt kolonvev og ble bare sporadisk påvist i aggregater (fig3).

lymfoide aggregater i uc-kolon skilte seg ikke signifikant fra ensomme follikler i normalt kolon med hensyn til antall T-celler, B-celler, makrofager/ monocytter, granulocytter og nk-celler (fig.3). Videre ble ET FDC-nettverk lokalisert I b-cellesonen sett i begge typer strukturer. Aggregatene manglet imidlertid en typisk germinal senterlignende b-cellesone med løst pakkede B-celler som ses i normale ensomme follikler. Videre okkuperte aggregatene I UC kolon opp til 45% av lamina propria.

AGGREGATER I UC-KOLON ER KOLONISERT AV γδ t-CELLER

ET OVERRASKENDE stort antall celler i aggregatene var γδ t-celler (11 (7%) tcr-Γδ+ celler (n=9)) (figur 1b,3). I motsetning til dette ble nesten ingen γδ t-Celler påvist i follikler med normalt kolon (0,3 (0.3)% tcr-γδ+ celler (n=8) (p <0,001)) (fig 3). Antall tcr-γδ + celler i aggregatene økte med alvorlighetsgraden av sykdommen. Forholdet Mellom tcr-αβ+ celler og tcr-γδ + celler i aggregatene var 2,4 (0,9) i alvorlig syke uc-prøver (n=6), men varierte fra 1,3 til 42 i moderat syke prøver (n=3) og var >300 i normale kolonfollikler. I fem prøver ble frekvensene av γδ t-Celler både i aggregater og i lamina propria utenfor aggregatene bestemt. I aggregatene var frekvensen Av TcR-γδ+ celler 3,9 (2.5) ganger høyere enn utenfor aggregatene. TcR-γδ + celler i aggregatene uttrykte hovedsakelig Vδ 1 Mens de fleste celler som brukte vδ 2 ble funnet utenfor aggregatene. Den totale lpl-fraksjonen ble analysert For Vδ genbruk ved immunoflow cytometri på isolerte celler. I overensstemmelse med de immunhistokjemiske resultatene uttrykte 86 (10)% av tcr-γδ+cellene Vδ 1 Mens de resterende cellene uttrykte Vδ 2 (tabell4). I tråd med den ultrastrukturelle analysen av γδ+ T-Celler (se nedenfor), viste farging av tcr-γδ+ – celler ofte et ujevn eller flekket utseende på immunhistokjemi (figur 1b, INNFELT) og viste en relativt lav fluorescensintensitet i immunoflow cytometri (figur 4). På Grunn Av det heterogene fargemønsteret For TcR-γδ, Kan antall γδ+ t-celler være undervurdert. To fargeimmunoflow cytometrianalyser av isolert LPL viste at nesten alle γδ+ t-Celler uttrykte cd45r0. Opp til 15% av γδ+ t-Celler uttrykte cd8, men de fleste γδ+ t-celler Var cd4/CD8 DOBBELT NEGATIVE.

CD4 + CD28-αβ t-CELLER UTGJØR DEN VIKTIGSTE T-CELLEUNDERTYPEN I AGGREGATENE

Flertallet av t-Celler i aggregatene uttrykte tcr-αβ og andelen cd4 + CELLER var høyere enn andelen cd8 + CELLER (figur 3) med et gjennomsnittlig cd4/CD8-FORHOLD på 1,7 (0.7) (n=8). DOMINANSEN AV CD4 + – celler var enda mer uttalt når isolert LPL ble analysert (fig 4). To fargeimmunoflow cytometrianalyser av LPL viste at nesten ALLE CD4 + – celler uttrykte TcR-αβ (data ikke vist). CD8 + – celler ble bare funnet I t-celleområdet av aggregatene mens CD4 + – celler var tilstede både i t-celleområdet og spredt i B-celleområdet. I flere prøver oversteg summen AV CD4+ – og CD8 + – celler ANTALL CD3 + – celler og / eller TcR+ – celler. Dette gjenspeiler sannsynligvis undervurdering Av T-celler på grunn av lavt nivå ekspresjon AV CD3 / TcR kompleks snarere enn TILSTEDEVÆRELSEN AV CD4 / CD8 doble positive celler som bare 2,4 (1,3)% (n = 4) av den totale LPL var dobbelt positiv i immunoflow cytometri analyse (fig 4). Selv om mange celler som uttrykker t-celle co-reseptor CD28 ble spredt i lamina propria utenfor aggregatene (13 (2)% CD28 + celler( n=3)) INGEN CD28 + celler ble detektert i aggregatene (tabell 5; fig 1d).

det var ingen signifikante forskjeller i frekvensene og fenotypene til αβ t-Celleundergrupper mellom aggregater i uc-KOLON og ensomme follikler i kontrollkolon (fig.3).

DE FLESTE B-CELLER I AGGREGATENE UTTRYKKER IgM på OVERFLATEN

flertallet av celler i b-celleområdet av aggregater viste flekker av anti-IgM mAb (42 (5)% IgM + celler( n=4)) som tilsvarer 95 (7)% AV CD19/20/22+ celler. Imidlertid ble ikke mindre enn 19 (2)% av cellene i aggregatene uttrykt IgA og en liten brøkdel Av IgG+ – celler (3,3 (0,4)% (n=4)) også påvist. Disse dataene tyder på At B-celler i aggregatene uttrykker mer enn en immunoglobulinisotype og nylig kan ha gjennomgått klassebytte. Ingen ig + – celler viste cytoplasmatisk farging, noe som indikerer at plasmaceller ikke var tilstede i aggregatene. I kontrast ble plasmaceller funnet utenfor aggregatene.

IgM+ celler (28 (2)% (n=4)) i mindretall IgA+celler (14 (1)% (n=4)) Og IgG+ celler (2,2 (0,4)% (n=4)) i folliklene i kontrollkolon. Summen AV ig + – celler utgjorde imidlertid ANTALL CD19/20/22+ celler i individuelle prøver. Mer interessant, selv om det ikke var noen signifikant forskjell i Antall b-celler i follikler sammenlignet med aggregater (figur 3), var andelen overflate IgM + – celler, overflate Iga+ – celler og Overflate IgG + – celler signifikant høyere i aggregater AV UC-kolon enn i follikler av kontrollkolon (p<0,01 for alle tre isotyper).

UTTRYKK FOR SUBTYPE IKKE-BEGRENSEDE MARKØRER I LYMFOIDE AGGREGATER AV UC-KOLON

Omtrent 50% av cellene i lymfoide aggregater uttrykte minne – / aktiveringsmarkøren CD45R0 (tabell 5). Videre viste analyse av isolert LPL at CD45R0-og CD45RA-ekspresjonsceller hver utgjorde omtrent 50% av populasjonen (n = 4). Flertallet AV CD3 + – celler uttrykte CD45R0, men en signifikant brøkdel AV CD45RA uttrykte CD3 + – celler var også tilstede(fig 4). Flertallet AV CD45R0-ekspresjonscellene var T-celler og 20-40% AV CD45R0 + – cellene var B-celler. I to prøver summen AV CD45R0 og CD45RA uttrykke celler overskredet 100% tyder på at celler som uttrykker begge skjøte varianter kan være til stede samtidig.

flertallet AV MHC klasse II-ekspresjonsceller var lokalisert I B-celleområdet, men spredte MHC KLASSE II-positive celler ble sett I t-celleområdet (data ikke vist). Andelen celler som uttrykker HLA-DR var omtrent 50% (tabell 5). I fem prøver oversteg ANTALL hla-DR+ – celler antall B-celler, noe som indikerer at Noen T-celler i aggregatene (31-89% AV CD3+ – cellene i disse individuelle prøvene) også uttrykker HLA-DR. Lignende resultater ble oppnådd med tre prøver analysert FOR HLA-DQ-uttrykk (tabell5).

interessant nok ble integrin aeß 7, som er tilstede på et stort antall IEL i normal tarm, uttrykt på 26 (13)% av cellene i aggregatene (fig 1C, tabell 5). Positive celler viste en heterogen fordeling, med noen områder med mange positive celler og andre områder med få positive celler. Aeexpressing-cellene viste variasjon i intensiteten av farging (fig1C).

En tredjedel av lymfocytter i aggregatene uttrykte det antiapoptotiske proteinet bcl-2(fig 1F, tabell 5). Bcl – 2-uttrykksceller ble spredt over hele aggregatet. I normale ensomme follikler ble omtrent 10% av bcl – 2 positive celler sett. De var alle plassert I b-cellesonen.

ULTRASTRUKTURELL ANALYSE av γδ t-CELLER I UC-KOLON VISER INTERNALISERING og OVERFLATEDUNKREGULERING av TCR-γδ

immunoelektronmikroskopiundersøkelsen var fokusert på γδ t-celler i Uc-kolon. For sammenlignende formål analyserte vi også γδ t-Celler i normal tarmslimhinne. TcR-γδ ble påvist som forekomster av det elektrontette reaksjonsproduktet.

i normal kolon var reaksjonsproduktet homogent fordelt på celleoverflaten til alle γδ t-Celler funnet, både på de som befinner seg i lamina propria (figur 5a) og på intraepitelial γδ t-celler (figur 5b).

derimot viste γδ t-Celler i uc-KOLON ekstrem variabilitet i fordelingen av reaksjonsproduktet fra celleoverflate til cytoplasma. Vi identifiserte fem typer fargemønstre (fem morphotypes). γδ t-Celler av den første typen (figur 6a) viste en heterogen fordeling av reaksjonsproduktet på celleoverflaten. Noen utstilt enkelt positivt farget multivesicular organer. I γδ t-Celler av den andre typen ble reaksjonsproduktet sett på som knappe lineære klynger mer eller mindre tilfeldig fordelt over celleoverflaten (figur 6b). I tillegg ble noen grupperte forekomster lokalisert over og innenfor overflateinvaginasjoner som varierte fra grunne groper til dypere kolbeformede invaginasjoner (fig 6B, innfelt). Det var ikke mulig å bruke ekstra motfarging. Således, selv om noen av overflateinvaginasjonene lignet belagte groper, kunne vi ikke avgjøre om disse invaginasjonene var belagt eller ikke. I γδ t-Celler av den tredje typen var reaksjonsproduktet lokalisert som celleoverflateklynger, og også i cytoplasmatiske vakuoler med morfologiske egenskaper av endosomer (fig 6c). I γδ t-Celler av den fjerde typen var reaksjonsproduktet rikelig tilstede i cytoplasma, men knapt detekterbart på celleoverflaten (fig 6d, E, F). Reaksjonsproduktet farget mange cytoplasmatiske vesikler og vakuoler nær cellemembranen og også dypt i cellene nær kjernen. Positivt farget vesikler ble noen ganger sett i kontinuitet med plasmamembranen og lignet belagte vesikler (fig 6E). Tallrike multivesikulære legemer bestående av tett pakkede mikrovesikler ble også farget (fig 6F). γδ t-Celler av den femte typen var sjeldne (fig 6g, H). Denne morfotypen viste vanligvis sterk positiv farging av plasmamembranen og perinuclearrommet. Noen ganger reaksjonsproduktet farget ulike cytoplasmatiske vakuoler i forskjellige størrelser og former. Ingen åpenbar forskjell mellom individuelle UC-kolonprøver som ble studert ble sett.

i sammendraget viste flertallet av γδ t-Celler( morphotypes 1-4) i uc-KOLON cellulær lokalisering av reaksjonsproduktet sannsynligvis de forskjellige påfølgende trinnene av TcR Internalisering: dannelse av klynger, belagte groper, belagte vesikler, endosomer og multivesikulære legemer.30 et lite antall celler (morphotype 5) viste aktiv syntese Av tcr-γδ molekyler.