Karakterisering van het slijmvlies lymfoïde aggregaten in colitis ulcerosa: immuun cel fenotype en de TcR-γδ expressie | Gut

Resultaten

LEUKOCYTEN VORMEN DE BELANGRIJKSTE celtype IN ONTSTOKEN UC COLON EN DISTRIBUEREN ANDERS IN HET COLON MUCOSA VAN UC PATIËNTEN in VERGELIJKING MET CONTROLES

Twaalf monsters van ontstoken dikke darm van UC patiënten en 15 monsters van ogenschijnlijk normale dikke darm van patiënten zonder voorgeschiedenis van IBD werden onderworpen aan fenotypische analyse door immunohistochemistry. Negen van deze UC-monsters werden geclassificeerd als ernstig ziek. In deze werd het epitheel afgevlakt met verminderde aantallen bekercellen, vertakte crypten en occasionele ulceraties. Crypt abcessen waren gebruikelijk. De lamina propria bevatte talrijke verspreide leukocyten en basale lymfoïde aggregaten (fig 1A). Drie UC-exemplaren werden geclassificeerd als matig ziek. In al het epitheel was intact met licht verminderde aantallen bekercellen en geen/weinig vertakte crypten. De lamina propria bevatte verhoogde aantallen leukocyten en lymfoïde aggregaten waren aanwezig. De morfometrische analyse was gericht op de aggregaten.

de aggregaten bestonden uit nodulaire fuserende clusters van lymfocyten zonder typische reactieve centra. Ze bevonden zich tussen de basen van de crypten en de submucosa zonder duidelijk contact met het luminale epitheel (fig 1A). Echter, de nabijheid tussen cellen in de aggregaten en crypt epitheel werd vaak opgemerkt (fig 1A, D). De frequentie van aggregaten (aantal/oppervlakte) was vergelijkbaar in matig en ernstig ziek weefsel, variërend van 1,3 tot 4,9 aggregaten per mm2 lamina propria (tabel 3). Echter, het gebied van de lamina propria bezet door de aggregaten nam toe met de ernst van de ziekte en vormde maar liefst 45% van de lamina propria in ernstig zieke dikke darm van sommige patiënten (tabel 3). Normale Solitaire follikels in de controledarm kwamen niet vaak voor (minder dan 0,1 follikel/mm2 lamina propria, n=8).

ongeveer 75% van de cellen in de aggregaten waren leukocyten (74 (7)% CD45+ – cellen (n = 9)). Het aandeel leukocyten in Solitaire lymfoïde follikels was ook hoog (67 (6)% CD45+ – cellen (n=8)). Beide waarden kunnen worden onderschat omdat kleuring met anti-CD45 mAb heterogeen was. Deze heterogene kleuring kan, ten minste gedeeltelijk, worden verklaard door verminderde expressie van CD45 op geactiveerde B-cellen.

het aantal leukocyten zowel in de lamina propria buiten de aggregaten (26 (7)% CD45+ cellen (n=4)) als in de submucosa (8 (2)% CD45+ cellen (n=4)) was verhoogd in de UC colon vergeleken met de normale colon (15 (2)% CD45+ cellen in de lamina propria buiten de follikels en 4 (2)% CD45+cellen in de submucosa (n=4)).

intra-epitheliale leukocyten waren aanwezig in lagere frequenties in UC colon vergeleken met normale colon: 28 (7) CD45+ cellen/1000 epitheliale cellen in ernstig ziek colonweefsel (n=4) vergeleken met 66 (26) CD45+ cellen/1000 epitheliale cellen in controles (n=4, p=0,03). IEL werden voornamelijk gedetecteerd in het cryptale epitheel in UC colon, deels als gevolg van erosies van het luminale oppervlakte-epitheel. In een normale dikke darm werd >60% van IEL in het luminale epitheel aangetroffen. Dus als de dichtheid van IEL lager is in cryptal dan in luminal epitheel in normale colon de lagere frequentie van IEL in UC colon kan worden verklaard door het feit dat UC colon voornamelijk cryptal epitheel bevat.

aggregaten in het COLONWEEFSEL van UC-patiënten omvatten bijna uitsluitend T-en B-lymfocyten

aggregaten werden geanalyseerd op de aanwezigheid van de drie belangrijkste typen lymfocyten: T-cellen (anti-CD3 mAb), B-cellen (een mengsel van anti-CD19, anti-CD20 en anti-CD22 mAbs) en NK-cellen. Voor de analyse van NK-cellen werd gekozen voor anti-CD57 mAb, omdat we eerder hebben aangetoond dat αβ-En γδ T-cellen die de klassieke NK-celmarker CD56 uitdrukken, aanwezig zijn in de menselijke darmen.25 Anti-CD15 werd gebruikt om granulocyten, anti-CD14 voor bloedmonocyten/onlangs aangeworven macrofagen, en anti-CD68 voor weefselmacrofagen te ontdekken. Om folliculaire dendritische cellen (FDC) te detecteren, werden drie verschillende mAbs gebruikt (tabel 2). Anti-CD80 / B7. 1 werd gebruikt om cellen met antigeen te ontdekken die Functie voorstellen en anti-CD1a werd gebruikt als extra teller voor dendritische/Langerhanscellen. De resultaten van de immunomorfometrische analyse zijn samengevat in figuur 3. De twee belangrijkste celtypen waren T-en B-cellen en de som van CD3 + – cellen en CD19/20/22+cellen waren gelijk aan het aantal CD45+ – cellen in de meeste monsters (77 (12)% tegenover 74 (7)% CD45+ – cellen (n=9)). T-en B-cellen vormden even grote proporties van de cellen in de aggregaten. De aggregaten bevatten grote T-celgebieden zonder B-cellen en wederkerige gebieden die worden gedomineerd door B-cellen met slechts enkele verspreide T-cellen (fig 2A, B). De meeste aggregaten bestonden uit dichtgepakte cellen, maar in sommige gevallen werden beperkte gebieden van meer losgepakte cellen gedetecteerd in de B-celzone. Het aandeel B-cellen was significant hoger in aggregaten van ernstig zieke UC-colon in vergelijking met matig zieke weefsels (43 (8)v 30 (6); p=0,03), wat wijst op een groter belang van B-cellen in ernstige vormen van de ziekte. Solitaire follikels in normale dikke darm hadden een iets ander uiterlijk. Het centrum van de follikel bevatte losjes verpakte grote B-cellen met weinig of geen T-cellen, omgeven door een zone van zowel b-Als T-cellen en gebieden in de periferie die alleen T-cellen bevatten (fig.2D, E).

folliculaire dendritische cellen werden gedetecteerd in zeven van de negen UC-monsters met behulp van drie verschillende anti-FDC mAbs. Er werd geen verschil in kleuringspatronen gezien tussen de drie mAbs. De positief bevlekte folliculaire dendritische cellen vormden een netwerk dat in het B-celgebied van de aggregaten werd gevestigd (fig 2B, C). Hoewel elk aggregaat ten minste één B-celgebied bevatte, bevatte slechts ongeveer 40% een FDC-netwerk. FDC-netwerken werden nooit gezien in T-celgebieden. In normale dikke darm bevatte elke follikel een FDC-netwerk dat beperkt was tot het B-celgebied (fig.2E, F). CD80 / B7.1 + dendritische cellen waren ook aanwezig in de aggregaten van UC colon. Ze werden meestal gezien als enkele dendritische cellen omgeven door kleine CD80+ stippen tussen lymfocyten, vermoedelijk doorsneden van dendritische uitsteeksels. Af en toe kon een compleet netwerk van CD80+ cellen worden gezien (fig 1E). Dit netwerk bevond zich in een T-cel gebied. Er werden geen CD1a+ cellen met een dendritische morfologie ontdekt in de aggregaten.

hoewel het aandeel granulocyten, CD15 + – cellen, in de meeste UC-monsters verhoogd was, bevonden dergelijke cellen zich over het algemeen buiten de aggregaten (fig.3). Talrijke weefselmacrofagen, CD68 + cellen, waren aanwezig in de lamina propria buiten de aggregaten. In de aggregaten waren ze schaars en gelegen in de buitenrand (fig.3). In normale colon waren de meeste CD68+ – cellen gelokaliseerd in de nabijheid van het luminale epitheel.In slechts twee monsters werden 29 aggregaten met een significant aantal CD14+ – cellen gezien. Deze monsters hadden ook een hoge frequentie van CD14 + cellen in de submucosa (dat wil zeggen, ≈3,5% CD14+ cellen vergeleken met ≈1% CD14+ cellen in andere UC colon monsters en controle colon). Bovendien werden CD14 + – cellen geconcentreerd in de buurt van bloedvaten, wat suggereert dat er een voortdurende invasie van monocyten plaatsvindt. Er was geen duidelijke klinische parameter die kon verklaren waarom monocyte invasie had plaatsgevonden, met name in deze twee monsters. NK-cellen, CD57 + – cellen, waren zeldzaam in zowel UC-als normaal colonweefsel en werden slechts af en toe gedetecteerd in aggregaten (figuur 3).

de lymfoïde aggregaten in UC colon verschilden niet significant van solitaire follikels in normale colon met betrekking tot het aantal T-cellen, B-cellen, macrofagen/monocyten, granulocyten en NK-cellen (fig.3). Bovendien werd een FDC-netwerk in de B-celzone gezien in beide typen structuren. Nochtans, misten de aggregaten een typische germinal centrum – als celzone van B met losjes verpakte cellen van B die in normale Solitaire follikels wordt gezien. Bovendien bezetten de aggregaten in UC colon tot 45% van de lamina propria.

aggregaten IN UC-COLON worden gekoloniseerd door γδ T-cellen

een verrassend groot aantal van de cellen in de aggregaten waren γδ T-cellen (11 (7%) TcR-γδ+ cellen (n=9)) (fig.1B,3). In tegenstelling, werden bijna geen γδ T cellen gedetecteerd in follikels van normale dikke darm (0.3 (0.3)% TCR-γδ+ cellen (n=8) (p<0,001)) (fig 3). Het aantal TCR-γδ+ cellen in de aggregaten nam toe met de ernst van de ziekte. De verhouding tussen TCR-αβ+ – cellen en TCR-γδ+ – cellen in de aggregaten was 2,4 (0,9) in ernstig zieke UC-monsters (n=6), maar varieerde van 1,3 tot 42 in matig zieke monsters (n=3) en was >300 in normale colonfollikels. In vijf monsters werden de frequenties van γδ T-cellen zowel in aggregaten als in lamina propria buiten de aggregaten bepaald. In de aggregaten was de frequentie van TCR-γδ+ cellen 3,9 (2.5) keer hoger dan buiten de aggregaten. TcR-γδ + cellen in de aggregaten uitgedrukt voornamelijk Vδ1, terwijl de meeste cellen die Vδ2 werden gevonden buiten de aggregaten. De totale LPL fractie werd geanalyseerd voor vδ gengebruik door immunoflow cytometrie op geïsoleerde cellen. In overeenstemming met de immunohistochemische resultaten gaf 86 (10)% van de TCR-γδ+ – cellen Vδ1 af, terwijl de overige cellen vδ2 (tabel 4) uitdrukten. In lijn met de ultrastructurele analyse van γδ+ T cellen (zie hieronder), toonde het bevlekken van TCR-γδ+cellen vaak een fragmentarisch of gevlekte verschijning op immunohistochemie (fig 1B, inset) en toonde een vrij lage fluorescentieintensiteit in immunoflow cytometry (fig 4). Vanwege het heterogene kleuringspatroon voor TcR-γδ, kan het aantal γδ+ T-cellen een onderschatting zijn. De cytometrieanalyse van twee kleurenimmunoflow van geïsoleerde LPL toonde aan dat bijna alle γδ+ T cellen CD45R0 uitdrukten. Tot 15% van de γδ+ T-cellen uitgedrukt CD8 maar de meeste γδ + T-cellen waren CD4 / CD8 dubbel negatief.

De CD4+CD28−ν T-CELLEN VORMEN DE GROTE T-CEL SUBTYPE IN DE AGGREGATEN

De meerderheid van de T-cellen in de aggregaten uitgedrukt TcR-ν en het percentage CD4+ – cellen was hoger dan het percentage van de CD8+ cellen (fig 3) met een gemiddelde CD4/CD8 ratio van 1,7 (0.7) (n=8). De dominantie van CD4 + – cellen was nog meer uitgesproken wanneer geïsoleerde LPL werd geanalyseerd (fig.4). Twee kleurenimmunoflow cytometrie-analyse van LPL toonde aan dat bijna alle CD4+-cellen TCR-αβ tot expressie brachten (gegevens niet getoond). CD8 + cellen werden gevonden slechts in het celgebied van T van de aggregaten terwijl CD4+ cellen aanwezig waren zowel in het celgebied van T als verspreid in het celgebied van B. In Verscheidene steekproeven overschreed de som van CD4+ – en CD8+ – cellen het aantal CD3+ – cellen en/of TcR+ – cellen. Dit weerspiegelt waarschijnlijk onderschatting van T-cellen vanwege de lage expressie van het CD3/TCR-complex in plaats van de aanwezigheid van CD4 / CD8 dubbel positieve cellen aangezien slechts 2,4 (1,3)% (n=4) van de totale LPL dubbel positief was in immunoflow cytometrieanalyse (fig.4). Hoewel talrijke cellen die de T-cel co-receptor CD28 uitdrukken, buiten de aggregaten in lamina propria werden verspreid (13 (2)% CD28+ – cellen (n=3)), werden er geen CD28+ – cellen gedetecteerd in de aggregaten (tabel 5; fig 1D).

er waren geen significante verschillen in de frequenties en fenotypen van αβ T-celsubgroepen tussen aggregaten in UC colon en Solitaire follikels in controle colon (fig.3).

de meeste B-cellen in de aggregaten uiten IgM op hun oppervlak

de meerderheid van de cellen in het B-celgebied van de aggregaten vertoonden kleuring door anti-IgM mAb (42 (5)% IgM+ cellen (n=4)), overeenkomend met 95 (7)% van de CD19/20/22+ cellen. Echter, niet minder dan 19 (2)% van de cellen in de aggregaten uitgedrukt IgA en een kleine fractie van IgG+ cellen (3,3 (0,4)% (n=4)) werden ook gedetecteerd. Deze gegevens suggereren dat de cellen van B in de aggregaten meer dan één immunoglobuline-isotype uitdrukken en onlangs klassenomschakeling kunnen hebben ondergaan. Geen Ig + – cellen vertoonden cytoplasmatische kleuring, wat erop wijst dat plasmacellen niet aanwezig waren in de aggregaten. In tegenstelling, plasmacellen werden gevonden buiten de aggregaten.

IgM + – cellen (28 (2)% (n=4)) overtreffen IgA+ – cellen (14 (1)% (n=4)) en IgG+ – cellen (2,2 (0,4)% (n=4)) in de follikels van de controle-colon. De som van IG+ – cellen was echter gelijk aan het aantal CD19/20/22+ cellen in individuele monsters. Interessanter is dat, hoewel er geen significant verschil was in het aantal B-cellen in follikels in vergelijking met aggregaten (fig.3), het aandeel van oppervlakte-IgM+ – cellen, oppervlakte-IgA+ – cellen en oppervlakte-IgG+ – cellen significant hoger was in aggregaten van UC-colon dan in follikels van controle-colon (p<0,01 voor alle drie de isotypen).

expressie van SUBTYPE niet-beperkte MARKERS IN lymfoïde aggregaten van UC COLON

ongeveer 50% van de cellen in de lymfoïde aggregaten gaf de geheugen – /activeringsmarker CD45R0 weer (tabel 5). Bovendien bleek uit analyse van geïsoleerde LPL dat CD45R0-en CD45RA-expressiecellen elk ongeveer 50% van de populatie uitmaakten (n=4). Het merendeel van de CD3+ – cellen drukte CD45R0 uit, maar ook een significant deel van CD45RA-cellen die CD3+ uitdrukken was aanwezig (fig.4). De meerderheid van de CD45R0-expressiecellen waren T-cellen en 20-40% van de CD45R0 + – cellen waren B-cellen. In twee steekproeven overschreed de som van CD45R0 en CD45RA die cellen uitdrukken 100% die suggereren dat cellen die beide lasvarianten uitdrukken gelijktijdig aanwezig kunnen zijn.

de meerderheid van de MHC klasse II-expressiecellen bevond zich in het B-celgebied, maar verspreide MHC klasse II-positieve cellen werden gezien in het T-celgebied (gegevens niet getoond). Het aandeel cellen met HLA-DR was ongeveer 50% (tabel 5). In vijf monsters was het aantal HLA-DR+-cellen groter dan het aantal B-cellen, wat erop wijst dat sommige T-cellen in de aggregaten (31-89% van de CD3+ – cellen in deze individuele monsters) ook HLA-Dr uitdrukken vergelijkbare resultaten werden verkregen met drie monsters die werden geanalyseerd op HLA-DQ-expressie (tabel 5).

interessant is dat het integrine aEß7, dat aanwezig is op een groot aantal IEL in normale darm, werd uitgedrukt op 26 (13)% van de cellen in de aggregaten (fig.1C, tabel 5). Positieve cellen vertoonden een heterogene verdeling, met sommige gebieden met veel positieve cellen en andere gebieden met weinig positieve cellen. De aeexpress cellen toonden variatie in de intensiteit van het bevlekken (fig1C).

een derde van de lymfocyten in de aggregaten gaf het antiapoptotische eiwit bcl-2 weer (fig.1F, tabel 5). Bcl-2 die cellen uitdrukken werden verspreid over het gehele aggregaat. In normale Solitaire follikels werd ongeveer 10% van de Bcl-2 positieve cellen gezien. Ze zaten allemaal in de B-celzone.

ultrastructurele analyse van γδ T-cellen in UC COLON toont internalisatie en oppervlakte-downregulatie van TcR-γδ

het onderzoek naar de immunoelectronmicroscopie was gericht op γδ T-cellen in UC colon. Voor vergelijkende doeleinden analyseerden we ook γδ T-cellen in normale Dikke darmslijmvlies. TcR-γδ werd ontdekt als afzettingen van het elektronendichte reactieproduct.

In een normaal colon werd het reactieproduct homogeen verdeeld over het celoppervlak van alle gevonden γδ T-cellen, zowel op die in de lamina propria (fig.5A) als op de intra-epitheliale γδ T-cellen (fig. 5B).

in tegenstelling, de cellen van γδ T in UC-colon vertoonden extreme veranderlijkheid in distributie van het reactieproduct van celoppervlakte aan cytoplasma. We identificeerden vijf soorten kleuringspatronen (vijf morfotypen). γδ T-cellen van het eerste type (fig.6A) vertoonden een heterogene verdeling van het reactieproduct op het celoppervlak. Sommige vertoonden enkele positief gekleurde multivesiculaire lichamen. In γδ T cellen van het tweede type, werd het reactieproduct gezien als schaarse lineaire clusters min of meer willekeurig verdeeld over het celoppervlak (fig.6B). Bovendien werden enkele geclusterde afzettingen gelokaliseerd boven en binnen oppervlakteinvaginaties die varieerden van ondiepe kuilen tot diepere kolfvormige invaginaties (fig.6B, inzet). Het was niet mogelijk om extra tegenkleuring te gebruiken. Dus hoewel sommige van de oppervlakte invaginaties leken gecoate putten, konden we niet bepalen of deze invaginaties waren gecoat of niet. In γδ T cellen van het derde type werd het reactieproduct gevestigd als clusters van de celoppervlakte, en ook in cytoplasmic vacuolen met morfologische kenmerken van endosomen (fig 6C). In γδ T-cellen van het vierde type was het reactieproduct overvloedig aanwezig in het cytoplasma, maar nauwelijks waarneembaar op het celoppervlak (fig.6D, E, F). Het reactieproduct bevlekte talrijke cytoplasmic blaasjes en vacuolen dichtbij het celmembraan en ook diep in de cellen dicht bij de kern. Positief gekleurde blaasjes werden soms gezien in continuïteit met het plasmamembraan en leken op gecoate blaasjes (fig.6E). Talrijke multivesiculaire lichamen bestaande uit dicht opeengepakte microvesicles werden ook bevlekt (fig.6F). γδ T cellen van het vijfde type waren zeldzaam (fig 6G, H). Dit morfotype toonde meestal sterke positieve kleuring van het plasmamembraan en de perinucleaire ruimte. Soms bevlekt het reactieproduct diverse cytoplasmic vacuolen van verschillende grootte en vormen. Er werd geen duidelijk verschil gezien tussen de individuele onderzochte UC-colonmonsters.

samengevat, vertoonden de meerderheid van γδ T cellen (morfotypen 1-4) in UC colon cellulaire lokalisatie van het reactieproduct hoogstwaarschijnlijk die de verschillende opeenvolgende stappen van TCR internalisatie weerspiegelen: het vormen van clusters, met een laag bedekte putten, met een laag bedekte blaasjes, endosomen, en multivesicular lichamen.30 een klein aantal cellen (morfotype 5) toonde actieve synthese van TCR-γδ moleculen.