Caracterização dos agregados de linfóides mucosos na colite ulcerosa: fenótipo de células imunes e expressão TCR-γδ | Gut

resultados

leucócitos constituem o principal tipo de células no cólon inflamado do UC e distribuem-se de forma diferente na MUCOSA COLÓNICA de doentes com DC em comparação com os controlos

Doze amostras de cólon sigmóide inflamado de doentes com DC e 15 amostras de cólon sigmóide aparentemente normal de doentes sem história de DBC foram submetidas a análise fenotípica por meio de análises fenotípicas efectuadas por imunohistoquímica. Nove destas amostras foram classificadas como gravemente doentes. Nestes o epitélio foi achatado com um número reduzido de células de cálice, criptas ramificadas e ulcerações ocasionais. Os abcessos da cripta eram comuns. A propria de lâmina continha numerosos leucócitos dispersos, bem como agregados de linfóides basais (Fig. 1A). Três espécimes da UC foram classificados como moderadamente doentes. Em todo o epitélio estava intacto, com um número ligeiramente reduzido de células de cálice e poucas criptas ramificadas. A lâmina propria continha um aumento do número de leucócitos e de agregados linfóides. A análise morfométrica foi focada nos agregados.

os agregados incluíam aglomerados de linfócitos fundidos nodulares sem centros reactivos típicos. Eles estavam localizados entre as bases das criptas e da submucosa sem contato aparente com o epitélio luminal (Fig. 1A). No entanto, a proximidade entre as células dos agregados e o epitélio crípto foi frequentemente observada (Fig. 1A, D). A frequência dos agregados (número/área) foi semelhante no tecido de doença moderada e grave, variando de 1,3 a 4,9 agregados por mm2 de lâmina propria (Tabela 3). No entanto, a área da lâmina propria ocupada pelos agregados aumentou com a gravidade da doença e constituiu até 45% da lâmina propria em cólon gravemente doente de alguns pacientes (Tabela 3). Os folículos solitários normais no cólon de controlo foram pouco frequentes (menos de 0, 1 folículo/mm2 de lâmina propria, n=8).

aproximadamente 75% das células nos agregados eram leucócitos (74 (7)% de células CD45+ (n = 9)). A proporção de leucócitos em folículos linfóides solitários foi também elevada (67 (6)% de células CD45+(n=8)). Ambos os valores podem ser subestimados, uma vez que a coloração com o mAb anti-CD45 era heterogénea. Esta coloração heterogénea pode ser explicada, pelo menos em parte, pela diminuição da expressão do CD45 nas células B activadas.

o número de leucócitos tanto na lâmina propria fora dos agregados (26 (7)% de células CD45+ (n=4)) como na submucosa (8 (2)% de células CD45+ (n=4)) aumentou no cólon UC em comparação com o cólon normal (15 (2)% de células CD45+ na lâmina propria fora dos folículos e 4 (2)% de células CD45+na submucosa (n=4)).Leucócitos intra-epiteliais estiveram presentes em frequências mais baixas no cólon UC comparativamente ao cólon normal.: 28 (7) células CD45+/1000 células epiteliais em tecidos colónicos gravemente doentes (n=4) em comparação com 66 (26) células CD45+/1000 células epiteliais nos controlos (n=4, p=0, 03). IEL foram detectados principalmente dentro do epitélio cryptal no cólon UC, em parte devido a erosões do epitélio superficial luminal. No cólon normal, >60% do IEL estavam localizados no epitélio luminal. Assim, como a densidade do IEL é menor em cryptal do que no epitélio luminal no cólon normal, a menor frequência do IEL no cólon UC pode ser explicada pelo fato de que o cólon UC contém principalmente epitélio cryptal.Foram analisados agregados no tecido COLÓNICO dos doentes com UC quase exclusivamente constituídos por linfócitos T e B

para detecção da presença dos três principais tipos de linfócitos: células T (mAb anti-CD3), células B (uma mistura de MAB anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD22) e células NK. Para a análise das células NK, o mAb anti-CD57 foi escolhido como já demonstrámos anteriormente que as células αβ E γδ T que expressam o marcador de células NK clássico CD56 estão presentes no intestino humano.O Anti-CD15 foi utilizado para detectar granulócitos, anti-CD14 para monócitos sanguíneos/macrófagos recentemente recrutados e anti-CD68 para macrófagos tecidulares. Para detectar células dendríticas foliculares (FDC), foram utilizados três mAbs diferentes (Tabela 2). O anti-CD80 / B7.1 foi usado para detectar células com função de apresentação de antigénios e o anti-CD1a foi usado como marcador adicional para células dendríticas/Langerhans. Os resultados da análise imunomorfométrica estão resumidos na Figura 3. Os dois principais tipos de células foram as células T E B e a soma das células CD3+ e CD19/20/22+as células correspondem ao número de células CD45+ na maioria das amostras (77 (12)% em comparação com 74 (7)% de células CD45+ (n=9)). As células T e B constituíram proporções igualmente grandes das células nos agregados. Os agregados continham grandes áreas de células T sem células B e áreas recíprocas dominadas por células B com apenas algumas células T dispersas (Fig. 2A, B). A maioria dos agregados consistia em células densamente embaladas, mas em alguns casos áreas limitadas de células mais pouco embaladas foram detectadas na zona das células B. A proporção de células B foi significativamente maior em agregados de cólon UC gravemente doente em comparação com o tecido moderadamente doente (43 (8)v 30 (6); p=0, 03), sugerindo uma maior importância das células B em formas graves da doença. Os folículos solitários no cólon normal tinham um aspecto ligeiramente diferente. O centro do folículo continha células B grandes, com poucas ou nenhumas células T, rodeadas por uma zona de células B E T e áreas na periferia que continham apenas células T (Fig. 2D, e).

foram detectadas células dendríticas foliculares em Sete de nove amostras de UC utilizando três mAbs anti-FDC diferentes. Não se observaram diferenças nos padrões de coloração entre os três mAbs. As células dendríticas foliculares positivamente manchadas formaram uma rede que estava localizada na área da célula B dos agregados (fig 2B, C). Embora cada agregado contivesse pelo menos uma área de células B, apenas cerca de 40% continham uma rede FDC. As redes FDC nunca foram vistas em áreas de células T. No cólon normal, cada folículo continha uma rede FDC que estava confinada à área das células B (Fig. 2E, F). CD80/B7.1+ células dendríticas também estavam presentes nos agregados do cólon UC. Eles eram mais comumente vistos como células dendríticas únicas cercadas por pequenos pontos CD80+ entre linfócitos, presumivelmente seções cruzadas de protrusões dendríticas. Ocasionalmente, uma rede completa de células CD80+ pode ser vista (Fig. 1E). Esta rede foi localizada em uma área de T cell. Não foram detectadas células CD1a+ com morfologia dendrítica nos agregados.Embora a proporção de granulócitos, células CD15+, tenha sido elevada na maioria das amostras de UC, estas células estavam geralmente localizadas fora dos agregados (Fig. 3). Numerosos macrófagos tecidulares, células CD68+, estavam presentes na lâmina propria fora dos agregados. Nos agregados, eram escassos e situavam-se na orla exterior (Fig. 3). No cólon normal, a maioria das células CD68 + foram localizadas na proximidade do epitélio luminal.29 agregados com um número significativo de células CD14+ foram observados em apenas duas amostras. Estas amostras também tinham uma alta frequência de células CD14+na submucosa (isto é, ≈3,5% células CD14+ em comparação com ≈1% células CD14+ em outras amostras do cólon UC e controlar o cólon). Além disso, as células CD14+ estavam concentradas perto dos vasos sanguíneos, sugerindo invasão em curso dos monócitos. Não havia nenhum parâmetro clínico óbvio que pudesse explicar por que a invasão de monócitos havia ocorrido, particularmente nestas duas amostras. As células NK, células CD57+, foram raras tanto no tecido UC como no tecido normal do cólon e foram apenas ocasionalmente detectadas em agregados (fig3).

os agregados linfóides no cólon UC não diferiram significativamente dos folículos solitários no cólon normal no que respeita ao número de células T, células B, macrófagos/monócitos, granulócitos e células NK (Fig. 3). Além disso, uma rede FDC localizada na zona de células B foi observada em ambos os tipos de estruturas. No entanto, os agregados não tinham uma zona típica de células B germinais tipo central, com células B vagamente embaladas, que é vista em folículos solitários normais. Além disso, os agregados do cólon UC ocuparam até 45% da lâmina propria.

agregados no cólon UC são colonizados por células γδ T

um número surpreendentemente grande de células nos agregados foram células γδ T (11 (7%) células TcR-γδ+ (n=9)) (Fig. 1B,3). Em contraste, quase não foram detectadas células γδ T nos folículos do cólon normal (0, 3 (0.3) % de células TcR-γδ+ (n = 8) (p<0, 001) (Fig. 3). O número de células TcR-γδ+ nos agregados aumentou com a gravidade da doença. A razão entre as células TcR-αβ + e as células TcR-γδ+ nos agregados foi de 2, 4 (0, 9) em amostras UC gravemente doentes (n=6), mas variou de 1, 3 a 42 em amostras moderadamente doentes (n=3) e foi >300 em folículos normais do cólon. Em cinco amostras, determinaram-se as frequências das células γδ T tanto em agregados como em propria de lâmina fora dos agregados. Nos agregados, a frequência das células TcR-γδ+ foi de 3, 9 (2.5) vezes mais elevado do que fora dos agregados. As células TCR-γδ+ nos agregados expressaram principalmente Vδ1, enquanto que a maioria das células usando Vδ2 foram encontradas fora dos agregados. A fracção LPL total foi analisada para a utilização do gene Vδ por citometria imunoflow em células isoladas. De acordo com os resultados imunohistoquímicos, 86 (10)% das células TcR-γδ+expressaram Vδ1 enquanto as restantes células expressaram Vδ2 (quadro 4). Em linha com a análise ultra-estrutural das células γδ+ T (ver abaixo), a coloração das células TcR-γδ+mostrou frequentemente um aspecto irregular ou manchado na imunohistoquímica (Fig. 1B, inset) e mostrou uma intensidade de fluorescência relativamente baixa na citometria imunoflow (Fig. 4). Devido ao padrão heterogêneo de coloração para TcR-γδ, O número de células T γδ+ pode ser um subestimado. Duas análises de citometria imunoflow a cores da LPL isolada mostraram que quase todas as células γδ+ T expressavam CD45R0. Até 15% das células T γδ+ expressaram CD8, mas a maioria das células T γδ+ eram CD4/CD8 duplamente negativas.

as células CD4+CD28-αβ T constituem o principal subtipo de células T nos agregados

a maioria das células T nos agregados expressos TcR-αβ e a proporção de células CD4+ foi superior à proporção de células CD8+ (Fig. 3) com uma razão média CD4/CD8 de 1,7 (0.7) (n=8). A dominância das células CD4+ foi ainda mais pronunciada quando a LPL isolada foi analisada (Fig. 4). Duas análises de citometria imunoflow a cores da LPL mostraram que quase todas as células CD4+ expressaram TcR-αβ (dados não apresentados). As células CD8+ foram encontradas apenas na área das células T dos agregados, enquanto as células CD4+ estavam presentes tanto na área das células T como dispersas na área das células B. Em várias amostras, a soma das células CD4+ e CD8+ excedeu o número de células CD3+ e/ou células TcR+. Isto provavelmente reflecte a subestimação das células T devido à expressão de baixo nível do complexo CD3/TcR em vez da presença de células CD4/CD8 duplamente positivas, uma vez que apenas 2,4 (1,3)% (n=4) da LPL total eram duplamente positivos na análise de citometria imunoflow (Fig. 4). Embora numerosas células que expressaram o co-receptor CD28 da célula T tenham sido espalhadas na lâmina propria fora dos agregados (13 (2)% células CD28+ (n=3)), não foram detectadas células CD28+ nos agregados (quadro 5; Fig. 1D).

não houve diferenças significativas nas frequências e fenótipos dos subconjuntos das células αβ T entre agregados no cólon UC e folículos solitários no cólon de controlo (Fig. 3).

a maioria das células B dos agregados expressam IgM na sua superfície

a maioria das células na área das células B dos agregados mostrou coloração por mAb anti-IgM (42 (5)% de células IgM+ (n=4)) correspondente a 95 (7)% do CD19/20/22+ células. No entanto, não menos de 19 (2)% das células dos agregados expressos IgA e uma pequena fracção de células IgG+ (3, 3 (0, 4)% (n=4)) foram também detectadas. Estes dados sugerem que as células B nos agregados expressam mais do que um isótipo de imunoglobulina e podem ter sido recentemente submetidas a mudança de classe. Nenhuma célula Ig+ mostrou coloração citoplásmica, indicando que as células plasmáticas não estavam presentes nos agregados. Em contraste, as células plasmáticas foram encontradas fora dos agregados.

IgM + células (28 (2)% (n=4)) em menor número que as células IgA+(14 (1)% (n=4)) e IgG+ células (2, 2 (0, 4)% (n=4)) nos folículos do cólon de controlo. No entanto, a soma de células Ig+igualou o número de CD19/20/22+ células em amostras individuais. Mais interessante, embora não tenha havido diferença significativa no número de células B nos folículos em comparação com agregados (Fig. 3), a proporção de células IgM+de superfície, células IgA+ de superfície e células IgG+de superfície foi significativamente mais elevada nos agregados do cólon UC do que nos folículos do cólon de controlo (p<0, 01 para os três isotipos).

expressão de marcadores de subtipo não restrito em agregados linfóides do cólon UC

aproximadamente 50% das células nos agregados linfóides expressaram o marcador de memória/activação CD45R0 (quadro 5). Além disso, a análise da LPL isolada mostrou que as células que expressam CD45R0 e CD45RA constituíam aproximadamente 50% da população (n=4). A maioria das células CD3+ expressaram CD45R0, mas uma fração significativa das células CD45RA expressando CD3+ também estavam presentes (Fig. 4). A maioria das células que expressavam CD45R0 eram células T e 20-40% das células CD45R0+ eram células B. Em duas amostras, a soma das células que expressam CD45R0 e CD45RA excedeu 100% sugerindo que as células que expressam ambas as variantes podem estar presentes simultaneamente.

a maioria das células com expressão de classe II MHC estavam localizadas na área das células B, mas as células positivas de classe II dispersas MHC foram observadas na área das células T (dados não apresentados). A proporção de células que expressaram HLA-DR foi de aproximadamente 50% (tabela 5). Em cinco amostras, o número de células HLA-DR+ excedeu o número de células B, indicando que algumas células T nos agregados (31-89% das células CD3+nestas amostras individuais) também expressam resultados semelhantes de HLA-DR. foram obtidos com três amostras analisadas para a expressão HLA-DQ (quadro 5).Curiosamente, a integrina aEß7, que está presente num grande número de IEL no intestino normal, foi expressa em 26 (13)% das células dos agregados (Fig. 1C, quadro 5). Células positivas mostraram uma distribuição heterogênea, com algumas áreas com muitas células positivas e outras áreas com poucas células positivas. As células aeexpress mostraram variação na intensidade da coloração (fig1C).

um terço dos linfócitos nos agregados expressaram a proteína antiapoptótica bcl-2 (Fig. 1F, quadro 5). Células com expressão de Bcl-2 foram espalhadas por todo o agregado. Nos folículos solitários normais, foram observados cerca de 10% de células bcl-2 positivas. Estavam todos localizados na zona B.

ultraestrutural ANALYSIS OF γδ T CELLS IN UC COLON SHOW INTERNALISATION AND SURFACE DOWNREGULATION OF TcR-γδ

The immunoelectron microscopy investigation was focused on γδ T cells in UC colon. Para fins comparativos, analisámos também as células γδ T na mucosa colónica normal. TcR-γδ foi detectado como depósitos do produto de reação denso de elétrons.

no cólon normal, o produto da reacção foi homogeneamente distribuído na superfície celular de todas as células γδ T encontradas, tanto nas localizadas na propria de lâmina (Fig. 5A) como nas células γδ T intra-epiteliais (Fig. 5B).

em contraste, as células γδ T do cólon UC exibiram uma variabilidade extrema na distribuição do produto da reacção da superfície celular ao citoplasma. Identificamos cinco tipos de padrões de coloração (cinco morfótipos). as células T γδ do primeiro tipo (Fig. 6A) mostraram uma distribuição heterogénea do produto de reacção na superfície celular. Alguns exibiram corpos multivesiculares com manchas positivas. Em células T γδ do segundo tipo, o produto da reação foi visto como escassos aglomerados lineares distribuídos aleatoriamente sobre a superfície celular (Fig. 6B). Além disso, alguns depósitos agrupados foram localizados sobre e dentro de invaginações de superfície que variaram de poços rasos a invaginações em forma de frasco mais profundo (Fig. 6B, inset). Não foi possível usar contrastaining adicional. Assim, embora algumas das invaginações da superfície se assemelhassem a poços revestidos, não podíamos determinar se essas invaginações eram ou não revestidas. Nas células T γδ do terceiro tipo, o produto da reacção foi localizado como aglomerados de superfície celular, e também em vacúolos citoplásmicos com características morfológicas dos endossomas (Fig. 6C). Nas células γδ T do quarto tipo, o produto da reacção estava abundantemente presente no citoplasma, mas apenas detectável na superfície celular (Fig. 6D, E, F). O produto da reacção manchou numerosas vesículas citoplásmicas e vacúolos próximos da membrana celular e também profundas nas células próximas do núcleo. As vesículas com manchas positivas eram por vezes vistas em continuidade com a membrana plasmática e assemelhavam-se às vesículas revestidas (Fig. 6E). Numerosos corpos multivesiculares que consistiam em microvesículos apertados também estavam manchados (Fig. 6F). as células T γδ do quinto tipo foram raras (Fig. 6G, H). Este morfótipo geralmente mostrou uma forte coloração positiva da membrana plasmática e do espaço perinuclear. Às vezes, o produto de reação manchou diversos vacúolos citoplásmicos de diferentes tamanhos e formas. Não se observaram diferenças óbvias entre amostras individuais de cólon UC estudadas.

em resumo, a maioria das células T γδ (morfotipos 1-4) no cólon UC exibiu localização celular do produto de reação, refletindo muito provavelmente os diferentes passos consecutivos da internalização TcR: formação de aglomerados, fossos revestidos, vesículas revestidas, endossomas e corpos multivesiculares.Um pequeno número de células (morfotipo 5) mostrou a síntese activa das moléculas TcR-γδ.