Caracterizarea agregatelor limfoide ale mucoaselor în colita ulcerativă: fenotipul celulelor imune și expresia TcR-XV | intestin

rezultate

leucocitele constituie tipul principal de celule în colonul UC inflamat și se distribuie diferit în mucoasa colonică a pacienților cu UC comparativ cu grupul de control

douăsprezece probe de colon sigmoid inflamat de la pacienții cu UC și 15 probe de colon sigmoid aparent normal de la pacienții fără antecedente de IBD au fost supuse analiza fenotipică prin imunohistochimie. Nouă dintre aceste probe UC au fost clasificate ca fiind grav bolnave. În acestea epiteliul a fost aplatizat cu un număr redus de celule calice, cripte ramificate și ulcerații ocazionale. Abcesele criptelor erau frecvente. Lamina propria conținea numeroase leucocite împrăștiate, precum și agregate limfoide bazale (fig.1A). Trei exemplare UC au fost clasificate ca fiind moderat bolnave. În tot epiteliul a fost intact cu un număr ușor redus de celule calice și nu/puține cripte ramificate. Lamina propria conținea un număr crescut de leucocite și au fost prezente agregate limfoide. Analiza morfometrică a fost axată pe agregate.

agregatele cuprindeau grupuri nodulare de limfocite care fuzionează fără centri reactivi tipici. Acestea au fost situate între bazele criptelor și submucoasa fără contact aparent cu epiteliul luminal (fig.1A). Cu toate acestea, a fost adesea observată apropierea dintre celulele din agregate și epiteliul criptat (fig.1A, D). Frecvența agregatelor (număr/suprafață) a fost similară în țesutul bolnav moderat și sever, variind de la 1,3 la 4,9 agregate pe mm2 de lamina propria (tabelul 3). Cu toate acestea, suprafața laminei propria ocupată de agregate a crescut odată cu severitatea bolii și a constituit până la 45% din lamina propria în colonul grav bolnav de la unii pacienți (tabelul 3). Foliculii solitari normali din colonul martor au fost rare (mai puțin de 0,1 folicul/mm2 de lamina propria, n=8).

aproximativ 75% din celulele din agregate au fost leucocite (74 (7) % celule CD45+ (n = 9)). Proporția leucocitelor în foliculii limfoizi solitari a fost, de asemenea, ridicată (67 (6)% celule CD45+(n=8)). Ambele valori pot fi subestimate, deoarece colorarea cu MAB anti-CD45 a fost eterogenă. Această colorare eterogenă poate fi explicată, cel puțin parțial, prin scăderea expresiei CD45 pe celulele B activate.

numărul de leucocite atât în lamina propria în afara agregatelor [26 (7)% celule CD45+ (n=4)], cât și în submucoasă [8 (2)% celule CD45+ (n=4)] a fost crescut în colonul UC comparativ cu colonul normal [15 (2)% celule CD45+ în lamina propria în afara foliculilor și 4 (2)% celule CD45+în submucoasă (n=4)].

leucocitele intraepiteliale au fost prezente la frecvențe mai mici în colonul UC comparativ cu colonul normal: 28 (7) celule CD45+/1000 celule epiteliale în țesutul colonic grav bolnav (n=4) comparativ cu 66 (26) celule CD45+/1000 celule epiteliale în grupul de control (N=4, p=0,03). IEL au fost detectate în principal în epiteliul criptal din colonul UC, parțial datorită eroziunilor epiteliului de suprafață luminal. În colonul normal, > 60% din IEL au fost localizate în epiteliul luminal. Astfel, deoarece densitatea IEL este mai mică în epiteliul criptal decât în epiteliul luminal în colonul normal, frecvența mai mică a IEL în colonul UC poate fi explicată prin faptul că colonul UC conține în principal epiteliu criptal.

agregatele din țesutul COLONIC al pacienților cu UC cuprind aproape exclusiv limfocite T și B

agregatele au fost analizate pentru prezența celor trei tipuri majore de limfocite: Celulele T (anti-CD3 mAb), celulele B (un amestec de mab anti-CD19, anti-CD20 și anti-CD22) și celulele NK. Pentru analiza celulelor NK, s-a ales mAb anti-CD57, deoarece am arătat anterior că celulele T de la clasa A X-a și a X-A care exprimă markerul clasic de celule NK cd56 sunt prezente în intestinul uman.25 Anti-CD15 a fost utilizat pentru detectarea granulocitelor, anti-CD14 pentru monocitele din sânge/macrofagele recent recrutate și anti-CD68 pentru macrofagele tisulare. Pentru a detecta celulele dendritice foliculare (FDC), au fost utilizate trei mab-uri diferite (tabelul 2). Anti-CD80 / B7.1 a fost utilizat pentru detectarea celulelor cu funcție de prezentare a antigenului și anti-CD1a a fost utilizat ca marker suplimentar pentru celulele dendritice/Langerhans. Rezultatele analizei imunomorfometrice sunt rezumate în fig.3. Cele două tipuri majore de celule au fost celulele T și B și suma celulelor CD3 + și CD19/20/22+celulele au egalat numărul de celule CD45+ în majoritatea probelor [77 (12)% comparativ cu 74 (7)% celule CD45 + (n=9)]. Celulele T și B au constituit proporții la fel de mari ale celulelor din agregate. Agregatele conțineau zone mari de celule T fără celule B și zone reciproce dominate de celule B cu doar câteva celule T împrăștiate (fig.2A, B). Majoritatea agregatelor au constat din celule dens ambalate, dar în unele cazuri au fost detectate zone limitate de celule mai slab ambalate în zona celulei B. Proporția celulelor B a fost semnificativ mai mare în agregatele colonului UC grav bolnav comparativ cu țesutul moderat bolnav (43 (8)v 30 (6); p=0,03), sugerând o importanță crescută a celulelor B în formele severe ale bolii. Foliculii solitari din colonul normal au avut un aspect ușor diferit. Centrul foliculului conținea celule B mari ambalate slab, cu puține celule T, înconjurate de o zonă atât a celulelor B, cât și a celulelor T și zone din periferie care conțineau numai celule T (fig.2D, E).

celulele dendritice foliculare au fost detectate în șapte din nouă probe UC utilizând trei mab-uri anti-FDC diferite. Nu s-a observat nicio diferență în modelele de colorare între cele trei mab-uri. Celulele dendritice foliculare colorate pozitiv au format o rețea care a fost localizată în zona celulei B a agregatelor (fig.2B, C). Deși fiecare agregat conținea cel puțin o zonă de celule B, doar aproximativ 40% conținea o rețea FDC. Rețelele FDC nu au fost niciodată văzute în zonele celulelor T. În colonul normal, fiecare folicul conținea o rețea FDC care era limitată la zona celulei B (fig 2E, F). CD80 / B7.1 + celulele dendritice au fost, de asemenea, prezente în agregatele colonului UC. Acestea au fost cel mai frecvent văzute ca celule dendritice unice înconjurate de mici puncte CD80+ între limfocite, probabil secțiuni transversale ale proeminențelor dendritice. Ocazional se putea vedea o rețea completă de celule CD80 + (fig.1E). Această rețea a fost localizată într-o zonă de celule T. Nu au fost detectate celule CD1a+ cu morfologie dendritică în agregate.

deși proporția de granulocite, celule CD15+, a fost crescută în majoritatea probelor UC, astfel de celule au fost în general localizate în afara agregatelor (fig.3). Numeroase macrofage tisulare, celule CD68+, au fost prezente în lamina propria în afara agregatelor. În agregate au fost rare și situate în marginea exterioară (fig.3). În colonul normal, majoritatea celulelor CD68 + au fost localizate în apropierea epiteliului luminal.29 de agregate cu un număr semnificativ de celule CD14 + au fost observate în doar două probe. Aceste probe au avut, de asemenea, o frecvență ridicată a celulelor CD14+în submucoasă (adică, celule 3,5% cd14+ în comparație cu celule 1% CD14+ în alte probe de colon UC și colon martor). Mai mult, celulele CD14 + au fost concentrate în apropierea vaselor de sânge, sugerând invazia continuă a monocitelor. Nu a existat un parametru clinic evident care să explice de ce a avut loc invazia monocitelor, în special în aceste două probe. Celulele NK, celulele CD57+, au fost rare atât în UC, cât și în țesutul normal al colonului și au fost detectate doar ocazional în agregate (fig3).

agregatele limfoide din colonul UC nu au diferit semnificativ de foliculii solitari din colonul normal în ceea ce privește numărul de celule T, celule B, macrofage/monocite, granulocite și celule NK (fig.3). Mai mult, o rețea FDC situată în zona celulei B a fost văzută în ambele tipuri de structuri. Cu toate acestea, agregatelor le lipsea o zonă tipică de celule B asemănătoare Centrului germinal, cu celule B ambalate slab, care se observă în foliculii solitari normali. Mai mult, agregatele din colon UC au ocupat până la 45% din lamina propria.

agregatele din colonul UC sunt colonizate de celule T

un număr surprinzător de mare de celule din agregate au fost celule T (11 (7%) TCR-celule+ (N=9)) (fig.1b,3). În schimb, aproape nu au fost detectate celule T în foliculii de colon normal (0,3 (0.3) % TcR-celule (n=8) (p<0,001)) (fig.3). Numărul de celule TcR-XV + din agregate a crescut odată cu severitatea bolii. Raportul dintre celulele TcR-VIII+ și celulele TCR-VIII + din agregate a fost de 2,4 (0,9) în probele de UC grav bolnave (n=6), dar a variat de la 1,3 la 42 în probele moderat bolnave (n=3) și a fost >300 în foliculii de colon normali. În cinci eșantioane s-au determinat frecvențele celulelor T de ordinul zecimilor atât în agregate, cât și în lamina propria în afara agregatelor. În agregate, frecvența celulelor TcR-XV+ a fost de 3,9 (2.5) ori mai mare decât în afara agregatelor. Celulele TcR-XV+ din agregate au exprimat în principal V Xct1, în timp ce majoritatea celulelor care utilizează V Xct2 au fost găsite în afara agregatelor. Fracția totală de LPL a fost analizată pentru utilizarea genei V Inktiv prin citometrie imunoflow pe celule izolate. În acord cu rezultatele imunohistochimice, 86 (10)% din celulele TcR-VIII+au exprimat V CTX1, în timp ce celulele rămase au exprimat V CTX2 (TABLE4). În conformitate cu analiza ultrastructurală a celulelor T de tip VIII+ (vezi mai jos), colorația celulelor TCR-VIII+a prezentat adesea un aspect neuniform sau reperat pe imunohistochimie (fig.1b, inset) și a prezentat o intensitate relativ scăzută a fluorescenței în citometria imunoflow (Fig. 4). Din cauza modelului eterogen de colorare pentru TcR-inkt, numărul de celule T + int poate fi subestimat. Analiza citometrică imunoflow în două culori a LPL izolat a arătat că aproape toate celulele T+ T au exprimat cd45r0. Până la 15% din γδ+ celule T și-a exprimat CD8 dar cel mai γδ+ T celule CD4/CD8 dublu negativ.

celulele T CD4 + CD28-XV constituie subtipul principal de celule T în agregatele

majoritatea celulelor T din agregate au exprimat TCR-XV, iar proporția celulelor CD4+ a fost mai mare decât proporția celulelor CD8+ (fig 3) cu un raport mediu CD4/CD8 de 1,7 (0.7) (n=8). Dominanța celulelor CD4 + a fost și mai pronunțată atunci când au fost analizate LPL izolate (fig.4). Analiza citometrică a IMUNOFLOWULUI cu două culori a LPL a arătat că aproape toate celulele CD4+ au exprimat TcR-XV (datele nu sunt prezentate). Celulele CD8 + au fost găsite numai în zona celulei T a agregatelor, în timp ce celulele CD4+ au fost prezente atât în zona celulei T, cât și împrăștiate în zona celulei B. În mai multe probe, suma celulelor CD4+ și CD8+ a depășit numărul de celule CD3+ și/sau celule TcR+. Aceasta reflectă probabil subestimarea celulelor T din cauza expresiei de nivel scăzut a complexului CD3 / TcR, mai degrabă decât prezența celulelor duble pozitive CD4/CD8, deoarece doar 2,4 (1,3)% (n=4) din LPL total au fost dublu pozitive în analiza citometriei imunoflow (fig 4). Deși numeroase celule care exprimă co – receptorul celulelor T CD28 au fost împrăștiate în lamina propria în afara agregatelor (13 (2)% celule CD28+ (n=3)) nu au fost detectate celule CD28+ în agregate (tabelul 5; fig 1D).

nu s-au înregistrat diferențe semnificative în frecvențele și fenotipurile subseturilor de celule T de la numărul unu între agregatele din colonul UC și foliculii solitari din colonul martor (fig.3).

majoritatea celulelor B din agregate exprimă IgM pe suprafața lor

majoritatea celulelor din zona celulei B a agregatelor au prezentat colorare cu MAB anti-IgM (42 (5)% celule IgM +(n=4)) corespunzând la 95 (7)% din CD19/20/22+ celule. Cu toate acestea, nu mai puțin de 19 (2)% din celulele din agregate au exprimat IgA și o mică parte din celulele IgG+ (3,3 (0,4)% (n=4)) au fost, de asemenea, detectate. Aceste date sugerează că celulele B din agregate exprimă mai mult de un izotip de imunoglobulină și pot fi supuse recent comutării clasei. Nicio celulă Ig + nu a prezentat colorare citoplasmatică, indicând faptul că celulele plasmatice nu au fost prezente în agregate. În schimb, celulele plasmatice au fost găsite în afara agregatelor.

celule IgM+ (28 (2)% (n=4)) au depășit numărul de celule IgA+(14 (1)% (n=4)) și celule IgG+ (2, 2 (0, 4)% (n=4)) în foliculii colonului de control. Cu toate acestea, suma celulelor Ig + a egalat numărul de CD19/20/22+ celule în probe individuale. Mai interesant, deși nu a existat o diferență semnificativă în numărul de celule B din foliculi comparativ cu agregatele (fig.3), proporția celulelor IgM+de suprafață, a celulelor IgA+ de suprafață și a celulelor IgG+de suprafață a fost semnificativ mai mare în agregatele colonului UC decât în foliculii colonului de control (p<0,01 pentru toate cele trei izotipuri).

expresia markerilor de subtip nerestricționați în agregatele limfoide ale colonului UC

aproximativ 50% din celulele din agregatele limfoide au exprimat markerul de memorie/activare CD45R0 (tabelul 5). Mai mult, analiza LPL izolată a arătat că celulele care exprimă CD45R0 și CD45RA au constituit fiecare aproximativ 50% din populație (n=4). Majoritatea celulelor CD3 + au exprimat CD45R0, dar o fracțiune semnificativă a celulelor CD45RA care exprimă CD3+ au fost de asemenea prezente (fig 4). Majoritatea celulelor care exprimă CD45R0 au fost celule T și 20-40% din celulele CD45R0+ au fost celule B. În două probe, suma celulelor care exprimă CD45R0 și CD45RA a depășit 100% sugerând că celulele care exprimă ambele variante de îmbinare pot fi prezente simultan.

majoritatea celulelor care exprimă MHC clasa II au fost localizate în zona celulei B, dar celulele pozitive MHC clasa II împrăștiate au fost observate în zona celulei T (datele nu sunt prezentate). Proporția celulelor care exprimă HLA-DR a fost de aproximativ 50% (tabelul 5). În cinci probe, numărul de celule HLA-DR + a depășit numărul de celule B, indicând faptul că unele celule T din agregate (31-89% din celulele CD3+din aceste probe individuale) exprimă, de asemenea, HLA-DR.rezultate similare au fost obținute cu trei probe analizate pentru expresia HLA-DQ (table5).

interesant este faptul că integrina ae, care este prezentă pe un număr mare de IEL în intestinul normal, a fost exprimată pe 26 (13)% din celulele din agregate (fig.1C, tabelul 5). Celulele pozitive au prezentat o distribuție eterogenă, cu unele zone cu multe celule pozitive și alte zone cu puține celule pozitive. Celulele eeexprimante au prezentat variații ale intensității colorării (fig1C).

o treime din limfocitele din agregate au exprimat proteina antiapoptotică bcl-2 (fig.1F, tabelul 5). Celulele care exprimă Bcl-2 au fost împrăștiate pe întregul agregat. În foliculii solitari normali s-au observat aproximativ 10% din celulele bcl-2 pozitive. Toate au fost localizate în zona celulei B.

analiza ultrastructurală a celulelor T de la nivelul colonului UC arată internalizarea și reglarea descendentă a suprafeței TCR-XV

investigația microscopiei imunoelectronice a fost axată pe celulele T de la nivelul colonului UC de la nivelul colonului UC. În scopuri comparative, am analizat, de asemenea, celule T de la nivelul mucoasei normale a colonului. TcR-XV a fost detectat ca depozite ale produsului de reacție densă a electronilor.

În condiții normale de colon, produsul de reacție a fost distribuit omogen pe suprafața celulei de toate γδ T celulele găsit, atât pe cele situate în lamina propria (fig 5A) și pe intraepiteliala γδ T celule (fig 5B).

în contrast, celulele T din colonul UC au prezentat variabilitate extremă în distribuția produsului de reacție de la suprafața celulei la citoplasmă. Am identificat cinci tipuri de modele de colorare (cinci morfotipuri). celulele T de tip I (fig.6A) au prezentat o distribuție eterogenă a produsului de reacție pe suprafața celulei. Unii au prezentat corpuri multivesiculare colorate pozitiv. În celulele T de tip al doilea, produsul de reacție a fost văzut ca clustere liniare rare, distribuite mai mult sau mai puțin aleatoriu pe suprafața celulei (fig.6b). În plus, unele depozite grupate au fost localizate peste și în interiorul invaginațiilor de suprafață care au variat de la gropi puțin adânci până la invaginații mai adânci în formă de balon (fig 6B, inset). Nu a fost posibilă utilizarea contra-colorării suplimentare. Astfel, deși unele dintre invaginațiile de suprafață semănau cu gropi acoperite, nu am putut determina dacă aceste invaginații erau sau nu acoperite. În celulele T de tip al treilea, produsul de reacție a fost localizat ca clustere de suprafață celulară și, de asemenea, în vacuole citoplasmatice cu caracteristici morfologice ale endozomilor (fig.6C). În celulele T de tip al patrulea, produsul de reacție a fost prezent abundent în citoplasmă, dar abia detectabil pe suprafața celulei (fig.6D, E, F). Produsul de reacție a colorat numeroase vezicule citoplasmatice și vacuole în apropierea membranei celulare și, de asemenea, adânc în celulele apropiate de nucleu. Veziculele colorate pozitiv au fost uneori observate în continuitate cu membrana plasmatică și seamănă cu veziculele acoperite (fig 6E). Numeroase corpuri multivesiculare constând din microvesicule bine ambalate au fost, de asemenea, colorate (fig 6F). celulele T de tip al cincilea au fost rare (fig.6G, h). Acest morfotip a prezentat de obicei o colorare pozitivă puternică a membranei plasmatice și a spațiului perinuclear. Uneori, produsul de reacție a colorat diverse vacuole citoplasmatice de diferite dimensiuni și forme. Nu a fost observată nicio diferență evidentă între probele individuale de colon UC studiate.

pe scurt, majoritatea celulelor T (morfotipurile 1-4) din colonul UC au prezentat localizarea celulară a produsului de reacție reflectând cel mai probabil diferitele etape consecutive ale internalizării TCR: formarea de clustere, gropi acoperite, vezicule acoperite, endozomi și corpuri multivesiculare.30 un număr mic de celule (morphotype 5) a prezentat sinteza activă a moleculelor TcR-XV.