Karakterisering av mukosala lymfoida aggregat vid ulcerös kolit: immuncellsfenotyp och TCR-sacili expression | gut

resultat

leukocyter utgör den huvudsakliga celltypen i inflammerad UC-kolon och distribueras annorlunda i kolonslemhinnan hos UC-patienter jämfört med kontroller

tolv prover av inflammerad sigmoid-kolon från UC-patienter och 15 prover av uppenbarligen normal sigmoid-kolon från patienter utan historia av IBD utsattes för fenotypisk analys genom immunhistokemi. Nio av dessa UC-prover klassificerades som allvarligt sjuka. I dessa tillplattades epitelet med minskat antal bägarceller,grenade kryptor och enstaka sår. Crypt abscesser var vanliga. Lamina propria innehöll många spridda leukocyter såväl som basala lymfoida aggregat (fig 1A). Tre UC-prover klassificerades som måttligt sjuka. I allt epitel var intakt med något minskat antal bägarceller och inga/Få grenade krypter. Lamina propria innehöll ökat antal leukocyter och lymfoida aggregat var närvarande. Den morfometriska analysen fokuserades på aggregaten.

aggregaten omfattade nodulära sammanslagningskluster av lymfocyter utan typiska reaktiva centra. De var belägna mellan baserna av krypterna och submukosa utan uppenbar kontakt med det luminala epitelet (fig 1A). Emellertid noterades ofta närhet mellan celler i aggregaten och kryptepitelet (fig 1A, D). Frekvensen av aggregat (antal/område) var liknande i måttligt och allvarligt sjuk vävnad, från 1,3 till 4,9 aggregat per mm2 lamina propria (tabell 3). Emellertid ökade området för lamina propria som upptogs av aggregaten med svårighetsgraden av sjukdomen och utgjorde så mycket som 45% av lamina propria i allvarligt sjuk kolon från vissa patienter (tabell 3). Normala ensamma folliklar i kontrollkolon var sällsynta (mindre än 0,1 follikel/mm2 av lamina propria, n=8).

cirka 75% av cellerna i aggregaten var leukocyter (74 (7) % CD45+ – celler (n = 9)). Andelen leukocyter i ensamma lymfoida folliklar var också hög (67 (6)% CD45+ – celler (n=8)). Båda värdena kan underskattas eftersom färgning med anti-CD45 mAb var heterogen. Denna heterogena färgning kan förklaras, åtminstone delvis, genom minskat uttryck av CD45 på aktiverade B-celler.

antalet leukocyter både i lamina propria utanför aggregaten (26 (7)% CD45+ celler (n=4)) och i submukosa (8 (2)% CD45+ celler (n=4)) ökade i UC-kolon jämfört med normala kolon (15 (2)% CD45+ celler i lamina propria utanför folliklarna och 4 (2)% CD45+celler i submukosa (n=4)).

intraepiteliala leukocyter var närvarande i lägre frekvenser i UC-kolon jämfört med normal kolon: 28 (7) CD45+ celler/1000 epitelceller i allvarligt sjuk kolonvävnad (n=4) jämfört med 66 (26) CD45+ celler/1000 epitelceller i kontroller (n=4, p=0, 03). IEL detekterades huvudsakligen i kryptalepitelet i UC-kolon, delvis på grund av erosioner av luminal ytepitel. I normal kolon var >60% av IEL belägna i det luminala epitelet. Således som tätheten av iel är lägre i kryptal än i luminal epitel i normal kolon den lägre frekvensen av iel i UC kolon kan förklaras av det faktum att UC kolon innehåller huvudsakligen kryptal epitel.

aggregat i KOLONVÄVNADEN hos UC-patienter omfattar nästan uteslutande T-och B-lymfocyter

aggregat analyserades med avseende på närvaron av de tre huvudtyperna av lymfocyter: T-celler (anti-CD3 mAb), B-celler (en blandning av anti-CD19, anti-CD20 och anti-CD22 mAbs) och NK-celler. För analys av NK-celler valdes anti-CD57 mAb eftersom vi tidigare har visat att T-celler i T-celler som uttrycker den klassiska NK-cellmarkören CD56 finns i människans tarm.25 Anti-CD15 användes för att detektera granulocyter, anti-CD14 för blodmonocyter/nyligen rekryterade makrofager och anti-CD68 för vävnadsmakrofager. För att detektera follikulära dendritiska celler (FDC) användes tre olika mAbs (tabell 2). Anti-CD80 / B7.1 användes för att detektera celler med antigenpresenterande funktion och anti-CD1a användes som en ytterligare markör för dendritiska/Langerhans-celler. Resultaten av den immunomorfometriska analysen sammanfattas i fig 3. De två stora celltyperna var T – och B-celler och summan av CD3 + – celler och CD19/20/22+celler motsvarade antalet CD45 + celler i de flesta prover (77 (12)% jämfört med 74 (7)% CD45+ celler (n=9)). T-och B-celler utgjorde lika stora proportioner av cellerna i aggregaten. Aggregaten innehöll stora t-cellområden utan B-celler och ömsesidiga områden dominerade av B-celler med endast några spridda T-celler (fig 2a, B). De flesta aggregat bestod av tätt packade celler men i vissa fall detekterades begränsade områden med mer löst packade celler i b-cellzonen. Andelen B-celler var signifikant högre i aggregat av allvarligt sjukt UC-kolon jämfört med måttligt sjuk vävnad (43 (8)v 30 (6); p=0,03), vilket tyder på ökad betydelse av B-celler i svåra former av sjukdomen. Solitära folliklar i normal kolon hade ett något annorlunda utseende. Follikelns centrum innehöll löst packade stora B-celler med få om några T-celler, omgivna av en zon av både B-och T-celler och områden i periferin som endast innehöll T-celler (fig 2D, E).

follikulära dendritiska celler detekterades i sju av nio UC-prover med användning av tre olika anti-FDC mAbs. Ingen skillnad i färgningsmönster sågs mellan de tre mabsna. De positivt färgade follikulära dendritiska cellerna bildade ett nätverk som var beläget i aggregatets B-cellområde (fig 2B, C). Även om varje aggregat innehöll minst ett B-cellområde, innehöll endast cirka 40% ett FDC-nätverk. FDC-nätverk sågs aldrig i t-cellområden. I normal kolon innehöll varje follikel ett FDC-nätverk som var begränsat till B-cellområdet (fig 2e, F). CD80/B7.1 + dendritiska celler var också närvarande i aggregaten av UC-kolon. De sågs oftast som enstaka dendritiska celler omgivna av små CD80+ – prickar mellan lymfocyter, förmodligen tvärsnitt av dendritiska utsprång. Ibland kunde ett komplett nätverk av CD80+ – celler ses (fig 1E). Detta nätverk var beläget i ett t-cellområde. Inga CD1a + – celler med en dendritisk morfologi detekterades i aggregaten.

även om andelen granulocyter, CD15 + – celler, var förhöjd i de flesta UC-prover, var sådana celler i allmänhet belägna utanför aggregaten (fig 3). Många vävnadsmakrofager, CD68 + – celler, var närvarande i lamina propria utanför aggregaten. I aggregaten var de knappa och belägna i ytterkanten (fig 3). I normal kolon lokaliserades de flesta CD68 + – celler i närheten av det luminala epitelet.29 aggregat med signifikant antal CD14 + – celler sågs i endast två prover. Dessa prover hade också en hög frekvens av CD14+ – celler i submukosa (det vill säga 3,5% CD14+ – celler i 2% CD14+ – celler i andra UC-kolonprover och kontrollkolon). Vidare koncentrerades CD14+ – celler nära blodkärl, vilket tyder på pågående invasion av monocyter. Det fanns ingen uppenbar klinisk parameter som kunde förklara varför monocytinvasion hade inträffat, särskilt i dessa två prover. NK-celler, CD57 + – celler, var sällsynta både i UC och normal kolonvävnad och detekterades endast ibland i aggregat (fig3).

lymfoida aggregaten i UC-kolon skilde sig inte signifikant från ensamma folliklar i normal kolon med avseende på antal T-celler, B-celler, makrofager/monocyter, granulocyter och NK-celler (fig 3). Dessutom sågs ett FDC-nätverk beläget i b-cellzonen i båda typerna av strukturer. Aggregaten saknade emellertid en typisk germinal centrumliknande B-cellzon med löst packade B-celler som ses i normala ensamma folliklar. Dessutom upptog aggregaten i UC-kolon upp till 45% av lamina propria.

aggregat i UC-kolon koloniseras av T-celler i T-celler i T-celler

ett överraskande stort antal av cellerna i aggregaten var T-celler i T-celler i T-celler (11 (7%) TcR-TcR+ celler (n=9)) (Fig 1b,3). Däremot detekterades nästan inga T-celler i T-celler i folliklar av normal kolon (0,3 (0.3)% TCR-0,001+ celler (n=8) (p<0,001)) (fig 3). Antalet TCR-oc+ – celler i aggregaten ökade med svårighetsgraden av sjukdomen. Förhållandet mellan TCR-cellerna + och TCR-cellerna + i aggregaten var 2,4 (0,9) i allvarligt sjuka UC-prover (n=6) men varierade från 1,3 till 42 i måttligt sjuka prover (n=3) och var >300 i normala kolonfolliklar. I fem prover bestämdes frekvenserna för T-celler i T-celler både i aggregat och i lamina propria utanför aggregaten. I aggregaten var frekvensen av TCR-XX+ – celler 3,9 (2.5) gånger högre än utanför aggregaten. TCR-0 + celler i aggregaten uttryckte huvudsakligen V 1 medan de flesta celler som använde V 2 hittades utanför aggregaten. Den totala LPL-fraktionen analyserades med avseende på V-användning av genen för V-virus genom immunflödescytometri på isolerade celler. I överensstämmelse med de immunohistokemiska resultaten uttryckte 86 (10)% av TCR-megapixelcellerna+V-cellerna 1 medan de återstående cellerna uttryckte V-cellerna 2 (tabell4). I linje med den ultrastrukturella analysen av TCR + T-celler (se nedan) visade färgning av TCR-TCR+ – celler ofta ett fläckigt eller fläckigt utseende på immunhistokemi (Fig 1b, infälld) och visade en relativt låg fluorescensintensitet i immunflödescytometri (fig 4). På grund av det heterogena färgningsmönstret för TCR-GHz kan antalet TCR+ T-celler vara en underskattning. Tvåfärgsimmunoflowcytometrianalys av isolerad LPL visade att nästan alla 0 + T-celler uttryckte cd45r0. Upp till 15% av T-cellerna uttryckte CD8, men de flesta T-cellerna var CD4/CD8 DUBBELNEGATIVA.

CD4 + CD28-T-celler utgör den huvudsakliga T-cellens subtyp i aggregaten

majoriteten av T-cellerna i aggregaten uttryckte TCR-tubi och andelen CD4 + – celler var högre än andelen CD8+ – celler (fig 3) med ett genomsnittligt CD4/CD8-förhållande på 1,7 (0.7) (n = 8). Dominansen av CD4 + – celler var ännu mer uttalad när isolerad LPL analyserades (fig 4). Tvåfärgsimmunoflowcytometrianalys av LPL visade att nästan alla CD4 + – celler uttryckte TCR-Xiaomi (data visas inte). CD8 + – celler hittades endast i aggregatets t-cellområde medan CD4+ – celler var närvarande både i t-cellområdet och spridda i B-cellområdet. I flera prover översteg summan av CD4+ – och CD8+ – celler antalet CD3 + – celler och / eller TcR+ – celler. Detta återspeglar förmodligen underskattning av T-celler på grund av CD3/TCR-komplexets låga nivåuttryck snarare än närvaron av CD4/CD8 dubbla positiva celler eftersom endast 2, 4 (1, 3)% (n=4) av den totala LPL var dubbelt positiva i immunoflow cytometri analys (fig 4). Även om många celler som uttrycker t-cellsamreceptorn CD28 spriddes i lamina propria utanför aggregaten (13 (2) % CD28+ – celler (n=3)) detekterades inga CD28+ – celler i aggregaten (tabell 5; fig 1D).

det fanns inga signifikanta skillnader i frekvenser och fenotyper av undergrupper av T-celler i T-celler i T-celler mellan aggregat i UC-kolon och ensamma folliklar i kontrollkolon (fig 3).

de flesta B-celler i aggregaten uttrycker IgM på sin yta

majoriteten av cellerna i b-cellområdet av aggregat visade färgning av anti-IgM mAb (42 (5) % IgM + celler (n=4)) motsvarande 95 (7)% av CD19/20/22+ celler. Emellertid detekterades inte mindre än 19 (2)% av cellerna i aggregaten uttryckta iga och en liten fraktion av IGG+ – celler (3,3 (0,4)% (n=4)). Dessa data tyder på att B-celler i aggregaten uttrycker mer än en immunoglobulinisotyp och kan nyligen ha genomgått klassbyte. Inga ig + – celler visade cytoplasmatisk färgning, vilket indikerar att plasmaceller inte var närvarande i aggregaten. Däremot hittades plasmaceller utanför aggregaten.

IgM + celler (28 (2)% (n=4)) överträffade iga+celler (14 (1)% (n=4)) och IgG+ celler (2,2 (0,4)% (n=4)) i folliklarna i kontrollkolon. Summan av IG + – celler motsvarade emellertid antalet CD19/20/22+ celler i enskilda prover. Mer intressant, även om det inte fanns någon signifikant skillnad i antalet B-celler i folliklar jämfört med aggregat (fig 3), var andelen yt-IgM+ – celler, yt-iga+ – celler och yt-IGG+ – celler signifikant högre i aggregat av UC-kolon än i folliklar av kontrollkolon (p<0,01 för alla tre isotyperna).

uttryck av subtyp icke-begränsade markörer i lymfoida aggregat av UC-kolon

cirka 50% av cellerna i lymfoida aggregat uttryckte minnes – /aktiveringsmarkören CD45R0 (tabell 5). Dessutom visade analys av isolerade LPL att CD45R0-och CD45RA-Uttryckande celler var och en utgjorde cirka 50% av befolkningen (n=4). Majoriteten av CD3 + – celler uttryckte CD45R0 men en signifikant fraktion av CD45RA som uttryckte CD3 + – celler var också närvarande (fig 4). Majoriteten av CD45R0-Uttryckande celler var T-celler och 20-40% av CD45R0+ – cellerna var B-celler. I två prover översteg summan av CD45R0-och CD45RA-Uttryckande celler 100% vilket tyder på att celler som uttrycker båda skarvvarianterna kan vara närvarande samtidigt.

majoriteten av MHC klass II-Uttryckande celler var belägna i b-cellområdet men spridda MHC klass II-positiva celler sågs i t-cellområdet (data visas inte). Andelen celler som uttryckte HLA-DR var cirka 50% (tabell 5). I fem prover överskred antalet HLA-DR+ – celler antalet B-celler, vilket indikerar att vissa T-celler i aggregaten (31-89% av CD3+-cellerna i dessa enskilda prover) också uttrycker HLA-DR.liknande resultat erhölls med tre prover analyserade för HLA-DQ-uttryck (tabell5).

intressant är att integrin ae-7, som är närvarande på ett stort antal iel i normal tarm, uttrycktes på 26 (13)% av cellerna i aggregaten (fig 1C, tabell 5). Positiva celler visade en heterogen fördelning, med vissa områden med många positiva celler och andra områden med få positiva celler. De aEexpressing cellerna visade variation i intensiteten av färgning (fig1C).

en tredjedel av lymfocyterna i aggregaten uttryckte det antiapoptotiska proteinet bcl-2 (fig 1F, tabell 5). Bcl-2-Uttryckande celler spriddes över hela aggregatet. I normala ensamma folliklar sågs cirka 10% av BCL-2-positiva celler. De var alla belägna i b-cellzonen.

ultrastrukturell analys av T-celler i TC-kolon i UC-kolon visar internalisering och nedreglering av ytan av TCR-Macau

immunoelektronmikroskopiundersökningen fokuserades på T-celler i TC-kolon i UC. För jämförande ändamål analyserade vi också T-celler i normal kolonslemhinna. TCR-Macau detekterades som avsättningar av den elektrontäta reaktionsprodukten.

i normal kolon distribuerades reaktionsprodukten homogent på cellytan av alla T-celler i T-celler som hittades, både på de som finns i lamina propria (fig 5A) och på de intraepiteliala T-cellerna i T-celler i T-celler (Fig 5b).

däremot uppvisade T-celler i UC-kolon extrem variation i fördelningen av reaktionsprodukten från cellytan till cytoplasma. Vi identifierade fem typer av färgningsmönster (fem morfotyper). T-celler av den första typen (fig 6A) visade en heterogen fördelning av reaktionsprodukten på cellytan. Några uppvisade enstaka positivt färgade multivesikulära kroppar. I T-celler i T-celler av den andra typen sågs reaktionsprodukten som knappa linjära kluster mer eller mindre slumpmässigt fördelade över cellytan (fig 6B). Dessutom lokaliserades vissa grupperade avlagringar över och inom ytinvaginationer som varierade från grunda gropar till djupare kolvformade invaginationer (fig 6B, infälld). Det var inte möjligt att använda ytterligare motfärgning. Således även om vissa av ytan invaginationer liknade belagda gropar, vi kunde inte avgöra om dessa invaginationer var belagda eller inte. I T-celler av den tredje typen av reaktionsprodukten placerades som cellytakluster, och även i cytoplasmatiska vakuoler med morfologiska egenskaper hos endosomer (fig 6C). I T-celler av den fjärde typen av T-celler var reaktionsprodukten rikligt närvarande i cytoplasman men knappt detekterbar på cellytan (fig 6D, E, F). Reaktionsprodukten färgade många cytoplasmatiska vesiklar och vakuoler nära cellmembranet och också djupt i cellerna nära kärnan. Positivt färgade vesiklar sågs ibland i kontinuitet med plasmamembranet och liknade belagda vesiklar (fig 6E). Många multivesikulära kroppar bestående av tätt packade mikrovesiklar färgades också (fig 6F). T-celler av den femte typen var sällsynta (fig 6g, h). Denna morfotyp visade vanligtvis stark positiv färgning av plasmamembranet och perinukleärt utrymme. Ibland reaktionsprodukten färgade olika cytoplasmatiska vakuoler av olika storlekar och former. Ingen uppenbar skillnad mellan enskilda UC-kolonprover som studerades sågs.

Sammanfattningsvis uppvisade majoriteten av T-cellerna i T-cellerna (morfotyper 1-4) i UC-kolon cellulär lokalisering av reaktionsprodukten som troligen återspeglade de olika på varandra följande stegen av TcR-internalisering: formning av kluster, belagda gropar, belagda vesiklar, endosomer och multivesikulära kroppar.30 ett litet antal celler (morphotype 5) visade aktiv syntes av TCR-Kazakiska molekyler.