Laboratorio Schedl

Inducción IPTG y Extracción de Proteínas de bacterias

Preparada por Swathi Arur y Sudhir Nayak

La inducción en bacterias se puede realizar utilizando uno de dos métodos básicos. La inducción rápida no funciona para todas las proteínas y puede producir rendimientos subóptimos. La inducción lenta puede mejorar la solubilidad de algunas proteínas. El método que sea mejor para usted dependerá de su proteína en particular y de la aplicación. Si desea una solubilidad óptima, ambos deben probarse antes de escalar. Este protocolo es generalizado y variará en función de una variedad de factores, como la cepa bacteriana, la proteína recombinante y el plásmido original.

Inducción rápida

1) De una placa relativamente fresca (<4 semanas) elija una colonia y crezca O/N a 30C (o 37C) en 1-2 ml de AMPLIFICADOR LB+(u otra selección) en un tubo de tapa rápida de 15 ml en un rotador o agitador.

2) Diluir 1: 50 (1: 100 si 37C O/N) en 2 ml de LB+AMP y crecer 3-4 horas a 37 C en un tubo de tapa rápida de 15 ml en un rotador.

4) Prepare 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG en una cónica de 15 ml y precaliente a 37 C aproximadamente 10 minutos antes de usar.

5) Después de 3-4 horas, retire 1 ml de los tubos a 37 grados C y colóquelos en tubos de 1,5 ml etiquetados. Gire a máx., 30 segundos, RT y retire supe. Congele el pellet a -20 hasta que sea necesario. ESTE ES EL CONTROL NO INDUCIDO.

6) Agregue precalentado 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG al tubo de tapa rápida de 15 ml y vuelva a 37 C durante 3-4 horas. Esto devolverá el volumen final a 2 ml y la concentración final de IPTG a 0,5 mm.

7) Después de 3-4 horas, transfiera 1 ml de la muestra inducida a los tubos de 1,5 ml etiquetados y gire a máx., 30 segundos, RT y elimine supe. Congele el pellet a -20 hasta que sea necesario. ESTA ES LA MUESTRA INDUCIDA.

8) Preparación de muestras para SDS-PAGE: Agregue 100ul de 1 búfer de carga (consulte las soluciones a continuación) con 1% de BME a muestras no inducidas e inducidas. Vórtice de 10 segundos a 1 minuto o hasta que no haya grumos de bacterias. Hervir 3-5 minutos, girar a máx., 30 segundos, RT y cargar 5-25 ul (generalmente 10 ul) dependiendo del gel (cantidad de proteína, tamaño de pellet, occidental, etc.).

Inducción lenta

Para inducción lenta de proteínas siga el protocolo de inducción rápida con los siguientes cambios:

6) Agregue 20 C 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG al tubo de tapa rápida de 15 ml e incube girando o agitando a 20 C durante 12-16 horas. Esto devolverá el volumen final a 2 ml y la concentración final de IPTG a 0,5 mm.

7) Después de 12-16 horas, transfiera 1 ml de la muestra inducida a los tubos de 1,5 ml etiquetados y gire a máx., 30 segundos, RT y elimine supe. Congele el pellet a -20 hasta que sea necesario. ESTA ES LA MUESTRA INDUCIDA.

NOTAS para la inducción:

* Los tiempos de inducción varían de 2 a 5 horas.

* IPTG se puede variar de 0,1 a 1,0 M.

* Si hierve la muestra demasiado tiempo, se volverán viscosas por la liberación total de ADN celular. Aún puede usarlos si puede encontrar un área de baja viscosidad, sin embargo, generalmente es mejor repetir el experimento.

Extracción de proteínas solubles

1) Lave el pellet bacteriano con 2 ml de STE helada (10 mm Tris, pH 8.0; 150 mm Nacl; 1 mm EDTA) una vez.

2) Resuspender la pastilla bacteriana (de un cultivo inducido de 10 ml) en 800ul de STE que contiene 100ug/ml de Lisozima (añadida inmediatamente antes de la resuspensión)

3) Incubar en hielo durante 15 minutos.

4) Agregue TDT a una concentración final de 5 mm ( tenemos existencias a 1 M en -20).

5) Añadir inhibidores de la proteasa.

6) Las bacterias se lisan mediante la adición de N-laurilsarcosina (Sarkosil) de una reserva al 10% (p/v) en STE. La concentración final de N-lauril sarcosina debe ser del 1,5%.

7) Sonicar las células en el sonicador de baño pequeño con 2 ciclos (6 minutos cada uno). El sonicador se apaga automáticamente después de 6 minutos.

8) Centrifugar el lisado durante 5 minutos a 4 ° C.

9) Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y añadir Triton X-100 (de un 10% de stock fabricado en STE) a una concentración final del 2%.

10) Tome 100ul de gel de agarosa Ni-NTA y lávese dos veces por centrifugación con PBS helado a 1000 rpm durante 1 minuto. cada

11) Agregue las perlas al tubo eppendorf que contiene el lisado y el tubo Triton X-100 e incube en un tuerca o eje de balancín en RT durante 30-60 minutos.

12) Lave las perlas 4 VECES con 1 ml de PBS heladas que contienen imidiazol de 20 mm a 1000 rpm durante 1 minuto cada una.

13) Agregue 1 búfer de carga con 1% BME, hierva 3 minutos y analice en la PÁGINA SDS.

NOTAS para la extracción:

* Este protocolo básico funcionará para etiquetas de BANDERA, GST y 6HIS epítopo. No ha sido probado para MBP, que no responde a los detergentes.

* La inclusión de imidiazol es específica para 6HIS tags.

* TWEEN20 a 0,1-1% también se puede incorporar al búfer de lavado para reducir el fondo si es necesario.

Soluciones

Búfer de carga (Para hacer un stock 4X)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% de Glicerol (4,0 ml 10% de Glicerol)

12,5 mm EDTA (1,0 ml 0,5 M EDTA)

0,02% de azul de Bromofenol (8 mg de azul de Bromofenol)

Añadir 2(o beta)-mercaptoetanol fresco (BME) al 1% antes de usar.