Schedl Lab

IPTG Induktion und Extraktion von Proteinen aus Bakterien

Hergestellt von Swathi Arur und Sudhir Nayak

Die Induktion in Bakterien kann mit einer von zwei grundlegenden Methoden durchgeführt werden. Schnelle Induktion funktioniert nicht für alle Proteine und kann zu suboptimalen Erträgen führen. Langsame Induktion kann die Löslichkeit einiger Proteine verbessern. Die Methode, die für Sie am besten geeignet ist, hängt von Ihrem speziellen Protein und der Anwendung ab. Wenn Sie eine optimale Löslichkeit wünschen, sollten beide vor dem Skalieren getestet werden. Dieses Protokoll ist verallgemeinert und variiert basierend auf einer Vielzahl von Faktoren wie dem Bakterienstamm, dem rekombinanten Protein und dem Elternplasmid.

Schnelle Induktion

1) Wählen Sie aus einer relativ frischen Platte (< 4 Wochen) eine Kolonie und wachsen Sie O / N bei 30C (oder 37C) in 1-2 ml LB + AMP (oder einer anderen Auswahl) in einem 15 ml Schnappverschlussröhrchen auf einem Rotator oder Schüttler.

2) Verdünnen 1:50 (1:100 wenn 37C O/N) in 2 ml LB + AMP und wachsen 3-4 stunden bei 37 C in 15 ml snap cap rohr in einem rotator.

4) Bereiten Sie 1 ml LB + AMP + 1 Mm IPTG in einem 15-ml-Gefäß vor und erwärmen Sie es etwa 10 Minuten vor dem Gebrauch auf 37 C.

5) nach 3-4hrs entfernen 1 ml von rohre zu 37deg C und ort in beschriftet 1,5 ml rohre. Spin bei max, 30sec, RT, und entfernen supe. Pellet bei -20 einfrieren, bis es benötigt wird. DIES IST DIE UNGEBREMSTE KONTROLLE.

6) Vorgewärmtes 1 ml LB + AMP + 1 mm IPTG in das 15 ml Schnappverschlussröhrchen geben und 3-4 Stunden auf 37 C stellen. Dadurch wird das endgültige Volumen wieder auf 2 ml und die endgültige Konzentration von IPTG auf 0,5 mm eingestellt.

7) Nach 3-4 Stunden 1 ml von der induzierten Probe in markierte 1,5 ml-Röhrchen überführen und bei max. 30 sek. Pellet bei -20 einfrieren, bis es benötigt wird. DIES IST DIE INDUZIERTE PROBE.

8) Probenvorbereitung für SDS-PAGE: 100ul 1X Ladungspuffer (siehe Lösungen unten) mit 1% BME zu uninduzierten und induzierten Proben geben. Vortex für 10 Sekunden bis 1 Minute oder bis keine Bakterienklumpen mehr vorhanden sind. Kochen 3-5min, spin bei max, 30sec, RT, und last 5-25ul (in der regel 10ul) je nach gel (menge von protein, größe von pellet, Temperatur, etc.).

Langsame Induktion

Zur langsamen Induktion von Protein folgen Sie dem Schnellinduktionsprotokoll mit den folgenden Änderungen:

6) 20 C 1ml LB + AMP+ 1mM IPTG zu 15ml Snap Cap Tube geben und 12-16 Stunden bei 20 C drehen oder schütteln inkubieren. Dadurch wird das endgültige Volumen wieder auf 2 ml und die endgültige Konzentration von IPTG auf 0,5 mm eingestellt.

7) Nach 12-16 Stunden 1 ml von der induzierten Probe in markierte 1,5 ml-Röhrchen überführen und bei max. 30 sek. Pellet bei -20 einfrieren, bis es benötigt wird. DIES IST DIE INDUZIERTE PROBE.

HINWEISE für induktion:

* Induktion mal variieren von 2-5hrs.

*IPTG kann von 0,1-1,0 M variiert werden.

*Wenn Sie Ihre Probe zu lange kochen, werden sie durch die vollständige Freisetzung von zellulärer DNA viskos. Sie können sie immer noch verwenden, wenn Sie einen Bereich mit niedriger Viskosität finden, es ist jedoch normalerweise besser, das Experiment zu wiederholen.

Extraktion löslicher Proteine

1) Waschen Sie das Bakterienpellet einmal mit 2 ml eiskaltem STE (10 mm Tris, pH 8,0; 150 Mm Nacl; 1 mm EDTA).

2) Resuspendieren Sie das Bakterienpellet (aus einer 10 ml induzierten Kultur) in 800ul STE mit 100 ug / ml Lysozym (unmittelbar vor der Resuspension zugegeben)

3) 15 Minuten auf Eis inkubieren.

4) Fügen Sie DTT zu einer Endkonzentration von 5 mm hinzu (wir haben Lagerbestände bei 1 M in -20).

5) Fügen Sie Proteaseinhibitoren hinzu.

6) Bakterien werden dann durch Zugabe von N-Laurylsarcosin (Sarkosyl) aus einem 10%igen (w/v) Vorrat in STE. Die Endkonzentration von N-Laurylsarcosin sollte 1,5% betragen.

7) Beschallen Sie die Zellen im kleinen Badschallgerät mit für 2 Zyklen (je 6min). Der Sonicator schaltet sich nach 6 Minuten automatisch aus.

8) Zentrifugieren Sie das Lysat für 5min bei 4 C.

9) Überführen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen und geben Sie Triton X-100 (aus einem 10% igen Vorrat aus STE) bis zu einer Endkonzentration von 2% hinzu.

10) Nehmen Sie 100ul Ni-NTA-Agarosegel und waschen Sie es zweimal durch Zentrifugation mit eiskaltem PBS bei 1000 U / min für 1 min.

11) Die Beads in das eppendorf-Röhrchen mit dem Lysat und das Triton X-100-Röhrchen geben und 30-60min bei RT auf einem Nutator oder einer Wippe inkubieren.

12) Waschen Sie die Perlen 4X mit 1 ml eiskaltem PBS mit 20 Mm Imidiazol bei 1000 U / min für jeweils 1 Minute.

13) 1X Ladepuffer mit 1% BME zugeben, 3min kochen und auf SDB-SEITE analysieren.

HINWEISE zur Extraktion:

*Dieses Basisprotokoll funktioniert für FLAG-, GST- und 6HIS-Epitop-Tags. Es wurde nicht auf MBP getestet, das nicht gut auf Reinigungsmittel anspricht.

*Die Aufnahme von Imidiazol ist spezifisch für 6HIS-Tags.

*TWEEN20 bei 0,1-1% kann auch in den Waschpuffer integriert werden, um den Hintergrund bei Bedarf zu reduzieren.

Lösungen

Beladungspuffer (zur Herstellung eines 4X-Vorrats)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1 M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% Glycerin (4,0 ml 10% Glycerin)

12,5 mM EDTA (1,0 ml 0,5 M EDTA)

0,02% Bromphenolblau (8 mg Bromphenolblau)

Fügen Sie frisches 2 (oder Beta) -Mercaptoethanol (BME ) zu 1% vor der verwendung.