Schedl Lab

Indukcja Iptg i ekstrakcja białek z bakterii

przygotowanych przez Swathi Arur i Sudhir Nayak

Indukcja u bakterii może być przeprowadzona przy użyciu jednej z dwóch podstawowych metod. Szybka indukcja nie działa na wszystkie białka i może dać nieoptymalne plony. Powolna indukcja może zwiększyć rozpuszczalność niektórych białek. Metoda, która jest najlepsza dla ciebie będzie zależeć od konkretnego białka i aplikacji. Jeśli chcesz uzyskać optymalną rozpuszczalność, oba należy przetestować przed skalowaniem. Protokół ten jest uogólniony i będzie się różnić w zależności od różnych czynników, takich jak szczep bakteryjny, rekombinowane białko i macierzysty plazmid.

szybka indukcja

1) ze stosunkowo świeżej płytki (< 4 tygodnie) wybierz kolonię i rozwijaj O/N w temperaturze 30 ° C (lub 37 ° C) W 1-2 ml LB+AMP (lub inny wybór) w tubie zatrzaskowej 15 ml na rotatorze lub shakerze.

2) rozcieńczyć 1: 50 (1: 100, jeśli 37 ° C O/N) W 2 ml LB+AMP i wyhodować 3-4 godziny w 37 ° C w 15 ml rurce zatrzaskowej w rotatorze.

4) Przygotuj 1 ml LB + AMP+1 mm IPTG w stożku 15 ml i wstępnie nagrzać do 37 ° C około 10 minut przed użyciem.

5) Po 3-4 godzinach usuń 1 ml z probówek w temperaturze 37 ° C i umieść w etykietowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Spin na max, 30sec, RT, i usunąć supe. Zamrozić pellet w temperaturze -20 do czasu potrzebnego. TO JEST NIEZAUWAŻONA KONTROLA.

6) dodaj wstępnie napełniony 1 ml LB + AMP+1 mm IPTG do 15 ml rurki zatrzaskowej i wróć do 37 ° C na 3-4 godziny. Spowoduje to powrót ostatecznej objętości do 2 ml, a końcowe stężenie IPTG do 0,5 mM.

7) po 3-4 godzinach przenieś 1 ml z indukowanej próbki do oznakowanych probówek 1,5 ml i wiruj przy max, 30 sekund, RT i usuń supe. Zamrozić pellet w temperaturze -20 do czasu potrzebnego. TO JEST PRÓBKA INDUKOWANA.

8) przygotowanie próbki do SDS-PAGE: Dodaj 100ul bufora ładującego 1X (patrz roztwory poniżej) z 1% BME do niezauważonych i indukowanych próbek. Wir przez 10 sekund do 1 minuty lub do momentu, gdy nie ma grudek bakterii. Gotować 3-5min, spin na max, 30sek, RT i załadować 5-25ul (Zwykle 10ul) w zależności od żelu (ilość białka, wielkość granulki, Western itp.).

powolna indukcja

w przypadku powolnej indukcji białka postępuj zgodnie z protokołem szybkiej indukcji z następującymi zmianami:

6) dodaj 20 ° C 1 ml LB + AMP+1 mm IPTG do 15 ml rurki zatrzaskowej i inkubuj obracając lub wstrząsając w temperaturze 20 ° C przez 12-16 godzin. Spowoduje to powrót ostatecznej objętości do 2 ml, a końcowe stężenie IPTG do 0,5 mM.

7) po 12-16 godzinach przenieś 1 ml z indukowanej próbki do oznakowanych probówek 1,5 ml i wiruj przy max, 30 sekund, RT i usuń supe. Zamrozić pellet w temperaturze -20 do czasu potrzebnego. TO JEST PRÓBKA INDUKOWANA.

uwagi dotyczące indukcji:

* czasy indukcji wahają się od 2 do 5 godzin.

* IPTG można zmieniać w zakresie 0,1-1,0 M.

* jeśli zbyt długo zagotujesz próbkę, staną się lepkie od całkowitego uwolnienia komórkowego DNA. Nadal można ich używać, jeśli można znaleźć obszar o niskiej lepkości, jednak zwykle lepiej po prostu powtórzyć eksperyment.

ekstrakcja rozpuszczalnych białek

1) przepłukać osad bakteryjny 2 mililitrami lodowatego STE (10 mm Tris, pH 8,0; 150 mm Nacl; 1 mm EDTA) raz.

2) wymieszać osad bakteryjny (z hodowli indukowanej 10 ml) w 800ul STE zawierającym 100ug/ml lizozymu (dodanego bezpośrednio przed wymieszaniem)

3) inkubować na lodzie przez 15 minut.

4) Dodaj DTT do końcowego stężenia 5 mm(mamy zapasy na 1M w -20).

5) Dodać inhibitory proteazy.

6) bakterie są następnie lizowane przez dodanie N-laurylosarkozyny (Sarkozylu) z 10% (w/v) zapasów w STE. Końcowe stężenie sarkozyny N-laurylowej powinno wynosić 1,5%.

7)Sonikować komórki w małym sonikatorze kąpielowym przez 2 cykle (6 minut każdy). Sonikator automatycznie wyłącza się po 6 minutach.

8) odwirować lizat przez 5 minut w temperaturze 4 ° C.

9) przenieść supernatant do nowej rurki eppendorfa i dodać Triton X-100 (z 10% zapasów wykonanych w STE) do końcowego stężenia 2%.

10) Weź 100ul żelu agarozowego Ni-NTA i umyj dwukrotnie przez odwirowanie zimnym lodem PBS przy 1000 obr. / min przez 1 min. każdy

11) dodać kulki do rurki eppendorfa zawierającej lizat i rurkę Triton X-100 i inkubować na nutatorze lub wahaczu w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.

12) 4X umyć koraliki 1 ml zimnego PBS zawierającego 20 mm imidiazolu przy 1000 obr. / min przez 1 minutę każdy.

13) Dodaj 1x bufor ładowania z 1% BME, gotuj 3min i analizuj na stronie SDS.

uwagi do ekstrakcji:

*ten podstawowy protokół będzie działał dla znaczników FLAG, GST i 6his epitope. Nie został przetestowany pod kątem MBP, który nie reaguje na detergenty.

*włączenie Imidiazolu jest specyficzne dla znaczników 6HIS.

*TWEEN20 przy 0,1-1% można również włączyć do bufora myjącego, aby w razie potrzeby zmniejszyć tło.

roztwory

Bufor ładujący (aby uzyskać 4x zapas)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% glicerolu (4,0 ml 10% glicerolu)

12,5 mM EDTA (1,0 ml 0,5 m EDTA)

0,02% błękit Bromofenolowy (8 mg błękit Bromofenolowy)

dodaj świeży 2(lub beta)-merkaptoetanol (BME) do 1% przed użyciem.