Schedl Lab

Iptg Induksjon Og Ekstraksjon Av Proteiner Fra Bakterier

Fremstilt Av Swathi Arur Og Sudhir Nayak

Induksjon i bakterier kan utføres ved hjelp av en av to grunnleggende metoder. Rask induksjon virker ikke for alle proteiner og kan gi deg suboptimal avkastning. Langsom induksjon kan forbedre oppløseligheten av noen proteiner. Metoden som er best for deg, vil avhenge av ditt spesielle protein og applikasjonen. Hvis du vil ha optimal oppløselighet, bør begge testes før du skalerer opp. Denne protokollen er generalisert og vil variere basert på en rekke faktorer som bakteriestammen, rekombinant protein og overordnet plasmid.

Rask induksjon

1) fra en relativt fersk plate (<4 uker) velg en koloni og vokse O/N VED 30C (eller 37C) i 1-2ML LB+AMP (ELLER annet utvalg) i et 15ml snap cap rør på en rotator eller shaker.

2) Fortynn 1:50 (1: 100 hvis 37C O/N) i 2 ml LB + AMP og vokse 3-4 timer ved 37 C i 15 ml snap cap tube i en rotator.

4) Forbered 1 ml LB + AMP + 1 mm IPTG i en 15 ml konisk og forvarm til 37 C ca 10 min før bruk.

5) etter 3-4hrs fjerne 1ml fra rør på 37deg C og plasser i merket 1,5 ml rør. Spinn på maks, 30SEC, RT, og fjern supe. Frys pellet ved -20 til nødvendig. DETTE ER UNINDUCED KONTROLL.

6) Legg til forvarmet 1 ml LB + AMP + 1 mm IPTG til 15 ml snap cap tube og gå tilbake til 37 C i 3-4 timer. Dette vil få det endelige volumet tilbake til 2 ml og den endelige konsentrasjonen av IPTG til 0,5 mM.

7) etter 3-4 timer overfører 1 ml fra indusert prøve til merkede 1,5 ml rør og spinner ved maks, 30 sek, RT og fjerner supe. Frys pellet ved -20 til nødvendig. DETTE ER DEN INDUSERTE PRØVEN.

8) Prøvepreparering FOR SDS-SIDE: Legg til 100ul av 1x lastebuffer (se løsninger nedenfor) med 1% BME til ikke-induserte og induserte prøver. Vortex for 10 sek til 1 min eller til det ikke er klumper av bakterier. Kok 3-5min, spinn ved maks, 30sec, RT og last 5 – 25ul (vanligvis 10ul) avhengig av gel (mengde protein, størrelse på pellet, Vestlig, etc.).

Langsom induksjon

for langsom induksjon av protein, følg hurtig induksjonsprotokoll med følgende endringer:

6) Legg Til 20 C 1ml LB + AMP + 1MM IPTG til 15ml snap cap tube og inkuber roterende eller risting ved 20 C i 12-16 timer. Dette vil få det endelige volumet tilbake til 2 ml og den endelige konsentrasjonen av IPTG til 0,5 mM.

7) etter 12-16 timer overfører 1 ml fra indusert prøve til merkede 1,5 ml rør og spinner ved maks, 30 sek, RT og fjerner supe. Frys pellet ved -20 til nødvendig. DETTE ER DEN INDUSERTE PRØVEN.

MERKNADER for induksjon:

* Induksjonstider varierer fra 2-5 timer.

* IPTG kan varieres fra 0,1-1,0 M.

* hvis du koker prøven for lenge, vil de bli viskøse fra total frigjøring av cellulært DNA. Du kan fortsatt bruke dem hvis du finner et område med lav viskositet, men det er vanligvis bedre bare å gjenta eksperimentet.

Ekstraksjon Av Løselige Proteiner

1) Vask bakteriell pellet med 2mls iskald STE (10mm Tris, pH 8.0; 150mm Nacl; 1MM EDTA) en gang.

2) Resuspend bakteriepellet (fra en 10 ml indusert kultur) i 800ul STE inneholdende 100ug / ml Lysozym (tilsatt umiddelbart før resuspensjon)

3) Inkuberes på is i 15 minutter.

4) Legg DTT til en endelig konsentrasjon på 5mM(vi har aksjer PÅ 1m i -20).

5) Legg til proteasehemmere.

6) Bakterier lyseres deretter ved tilsetning Av N-laurylsarkosin (Sarkosyl) fra en 10% (w/v) lager I STE. Den endelige konsentrasjonen Av n-laurylsarkosin bør være 1,5%.

7) Sonikerer cellene i den lille badesonikatoren med i 2 sykluser(6min hver). Sonicatoren slår seg automatisk av etter 6 minutter.

8) Sentrifuger lysatet i 5 min ved 4 C.

9) Overfør supernatanten til et nytt eppendorf-rør og legg Til Triton X-100 (fra en 10% lager laget I STE) til en endelig konsentrasjon på 2%.

10) Ta 100ul Av Ni-NTA agarose gel og vask to ganger ved sentrifugering med iskald PBS ved 1000rpm for 1min. hver

11) Legg perlene til eppendorf-røret som inneholder lysatet og Triton X-100-røret og inkuber på en nutator eller rocker VED RT i 30-60min.

12) Vask perlene 4X MED 1 ml iskalde PBS som inneholder 20 mm imidiazol ved 1000 rpm i 1 minutt hver.

13) Legg TIL 1x lastebuffer med 1% BME, kok 3min, og analyser PÅ SDS-SIDEN.

MERKNADER for ekstraksjon:

* denne grunnleggende protokollen vil fungere FOR FLAGG -, GST – og 6his epitop-koder. DET har ikke blitt testet FOR MBP, som ikke svarer vilje til vaskemidler.

* Inkluderingen av Imidiazol er spesifikk FOR 6HANS koder.

* TWEEN20 ved 0,1-1% kan også innlemmes i vaskebufferen for å redusere bakgrunnen om nødvendig.

Løsninger

Lastebuffer (For Å lage En 4x Lager)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% Glyserol (4,0 ml 10% Glyserol)

12,5 mM EDTA (1,0 ml 0,5 M EDTA)

0,02% Bromfenolblå (8 mg Bromfenolblå)

Tilsett fersk 2(eller beta)-merkaptoetanol (BME) til 1% før bruk.