Schedl Lab

IPTG Induction and Extraction of Proteins from Bacterium

Preparato da Swathi Arur e Sudhir Nayak

L’induzione nei batteri può essere eseguita utilizzando uno dei due metodi di base. L’induzione rapida non funziona per tutte le proteine e può darti rese subottimali. L’induzione lenta può migliorare la solubilità di alcune proteine. Il metodo migliore per te dipenderà dalla tua particolare proteina e dall’applicazione. Se si desidera una solubilità ottimale, entrambi devono essere testati prima di scalare. Questo protocollo è generalizzato e varierà in base a una varietà di fattori come il ceppo batterico, la proteina ricombinante e il plasmide genitore.

Induzione veloce

1) Da un piatto relativamente fresco (<4 settimane) scegliere una colonia e crescere O/N a 30C (o 37C) in 1-2 ml LB+AMP (o altra selezione) in un tubo tappo a scatto da 15 ml su un rotatore o shaker.

2) Diluire 1: 50 (1: 100 se 37C O/N) in 2 ml LB+AMP e crescere 3-4 ore a 37 C in 15 ml snap cap tubo in un rotatore.

4) Preparare 1 ml LB + AMP + 1mm IPTG in un 15 ml conico e preriscaldare a 37 C circa 10 min prima dell’uso.

5) Dopo 3-4hrs rimuova 1ml dalle provette a 37deg C e disponga in provette etichettate da 1,5 ml. Spin a max, 30sec, RT, e rimuovere supe. Congelare pellet a -20 fino a quando necessario. QUESTO È IL CONTROLLO NON CONDOTTO.

6) Aggiungere pre-riscaldato 1 ml LB + AMP + 1mm IPTG a 15 ml tappo a scatto tubo e tornare a 37 C per 3-4 ore. Questo otterrà il volume finale di nuovo a 2 ml e la concentrazione finale di IPTG a 0.5 mM.

7) Dopo 3-4hrs trasferire 1 ml dal campione indotto a etichettato 1.5 ml tubi e spin a max, 30sec, RT, e rimuovere supe. Congelare pellet a -20 fino a quando necessario. QUESTO È IL CAMPIONE INDOTTO.

8) Preparazione del campione per SDS-PAGE: aggiungere 100ul di 1X buffer di carico (vedere soluzioni sotto) con 1% BME a campioni indotti e indotti. Vortex per 10sec a 1min o fino a quando non ci sono grumi di batteri. Far bollire 3-5min, spin a max, 30sec, RT e caricare 5-25ul (di solito 10ul) a seconda del gel (quantità di proteine, dimensione del pellet, occidentale, ecc.).

Induzione lenta

Per induzione lenta di proteine seguire il protocollo di induzione veloce con le seguenti modifiche:

6) Aggiungere 20 C 1 ml LB + AMP + 1mm IPTG a 15 ml snap cap tubo e incubare rotazione o agitazione a 20 C per 12-16 ore. Questo otterrà il volume finale di nuovo a 2 ml e la concentrazione finale di IPTG a 0.5 mM.

7) Dopo 12-16hrs trasferire 1 ml dal campione indotto a etichettato 1.5 ml tubi e spin a max, 30sec, RT, e rimuovere supe. Congelare pellet a -20 fino a quando necessario. QUESTO È IL CAMPIONE INDOTTO.

NOTE per l’induzione:

*I tempi di induzione variano da 2 a 5 ore.

*IPTG può essere variato da 0,1-1,0 M.

* Se si fa bollire troppo a lungo il campione, questi diventeranno viscosi a causa del rilascio totale del DNA cellulare. Puoi ancora usarli se riesci a trovare un’area di bassa viscosità, tuttavia, di solito è meglio ripetere l’esperimento.

Estrazione di proteine solubili

1) Lavare il pellet batterico con 2mls di STE ghiacciato (10mm Tris, pH 8.0; 150mm Nacl; 1mM EDTA) una volta.

2) Risospendere il pellet batterico (da una coltura indotta da 10 ml) in 800ul di STE contenente 100ug/ml di lisozima (aggiunto immediatamente prima della risospensione)

3) Incubare su ghiaccio per 15 minuti.

4) Aggiungere DTT ad una concentrazione finale di 5mM (abbiamo scorte a 1M in -20).

5) Aggiungere inibitori della proteasi.

6) I batteri vengono poi lisati mediante l’aggiunta di N-laurilsarcosina (Sarkosyl) da uno stock del 10% (p/v) in STE. La concentrazione finale di N-lauril sarcosina dovrebbe essere dell ‘ 1,5%.

7) Sonicare le cellule nel piccolo sonicator bagno con per 2 cicli (6 min ciascuno). Il sonicator si spegne automaticamente dopo 6 minuti.

8) Centrifugare il lisato per 5 minuti a 4 C.

9) Trasferire il surnatante in una nuova provetta di eppendorf e aggiungere Triton X-100 (da uno stock del 10% prodotto in STE) ad una concentrazione finale del 2%.

10) Prendere 100ul di gel di agarosio Ni-NTA e lavare due volte per centrifugazione con PBS ghiacciato a 1000rpm per 1min. ogni

11) Aggiungere le perline al tubo eppendorf contenente il lisato e il tubo Triton X-100 e incubare su un nutator o rocker a RT per 30-60min.

12) Lavare le perline 4X con 1 ml di PBS ghiacciato contenente 20mm di imidiazolo a 1000 rpm per 1 minuto ciascuno.

13) Aggiungi 1X buffer di caricamento con 1% BME, fai bollire 3min e analizza su SDS-PAGE.

NOTE per l’estrazione:

*Questo protocollo di base funzionerà per i tag FLAG, GST e 6HIS epitope. Non è stato testato per MBP, che non risponde volontà di detergenti.

*L’inclusione dell’imidiazolo è specifica per i tag 6HIS.

*TWEEN20 allo 0,1-1% può anche essere incorporato nel tampone di lavaggio per ridurre lo sfondo, se necessario.

Soluzioni

Loading Buffer (Per fare un 4X Stock)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2.0 ml 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

Glicerolo al 10% (4.0 ml di Glicerolo al 10%)

12,5 mM EDTA (1.0 ml 0,5 M EDTA)

0.02 % Blu di bromofenolo (8 mg di Blu di bromofenolo)

Aggiungi fresca 2(o beta)-mercaptoetanolo (BME) all ‘ 1% prima di utilizzare.