Schedl Lab

IPTG induktion och extraktion av proteiner från bakterier

framställd av Swathi Arur och Sudhir Nayak

induktion i bakterier kan utföras med en av två grundläggande metoder. Snabb induktion fungerar inte för alla proteiner och kan ge dig suboptimala utbyten. Långsam induktion kan förbättra lösligheten hos vissa proteiner. Den metod som är bäst för dig beror på ditt specifika protein och applikationen. Om du vill ha optimal löslighet bör båda testas innan du skalar upp. Detta protokoll är generaliserat och kommer att variera baserat på en mängd olika faktorer såsom bakteriestam, rekombinant protein och moderplasmid.

snabb induktion

1) från en relativt färsk platta (<4 veckor) plocka en koloni och växa O/N vid 30C (eller 37C) i 1-2ml LB+AMP (eller annat urval) i en 15ml snäpplock rör på en rotator eller shaker.

2) späd 1:50 (1:100 om 37C O/N) i 2 ml LB+AMP och växa 3-4 timmar vid 37 C i 15 ml snäpplock i en rotator.

4) Förbered 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG i en 15 ml konisk och förvärm till 37 C cirka 10 minuter före användning.

5) Efter 3-4 timmar avlägsna 1 ml från rören vid 37deg C och placera i märkta 1,5 ml rör. Snurra vid max, 30 sek, RT, och ta bort supe. Frys pellet vid -20 tills det behövs. DETTA ÄR DEN OINDUCERADE KONTROLLEN.

6) Lägg till förvärmd 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG till 15 ml snäpplock och återgå till 37 C i 3-4 timmar. Detta kommer att få den slutliga volymen tillbaka till 2 ml och den slutliga koncentrationen av IPTG till 0,5 mm.

7) efter 3-4 timmar överför 1 ml från inducerat prov till märkta 1,5 ml rör och snurra vid max, 30 sek, RT och ta bort supe. Frys pellet vid -20 tills det behövs. DETTA ÄR DET INDUCERADE PROVET.

8) provberedning för SDS-sida: Lägg till 100ul av 1x laddningsbuffert (se lösningar nedan) med 1% BME till oinducerade och inducerade prover. Vortex för 10sek till 1min eller tills det inte finns några klumpar av bakterier. Koka 3-5min, snurra vid max, 30sek, RT och ladda 5-25ul (vanligtvis 10ul) beroende på gel (mängd protein, pellets storlek, Västra, etc.).

långsam induktion

för långsam induktion av protein följ snabbt induktionsprotokoll med följande ändringar:

6) tillsätt 20 C 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG till 15 ml snäpplock och inkubera roterande eller skaka vid 20 C i 12-16 timmar. Detta kommer att få den slutliga volymen tillbaka till 2 ml och den slutliga koncentrationen av IPTG till 0,5 mm.

7) efter 12-16 timmar överför 1 ml från inducerat prov till märkta 1,5 ml rör och snurra vid max, 30 sek, RT och ta bort supe. Frys pellet vid -20 tills det behövs. DETTA ÄR DET INDUCERADE PROVET.

anmärkningar för induktion:

* Induktionstiderna varierar från 2-5hrs.

* IPTG kan varieras från 0,1-1,0 M.

* om du kokar ditt prov för länge blir de viskösa från total frisättning av cellulärt DNA. Du kan fortfarande använda dem om du kan hitta ett område med låg viskositet, men det är vanligtvis bättre att bara upprepa experimentet.

extraktion av lösliga proteiner

1) Tvätta bakteriepelleten med 2 ml iskall STE (10 mm Tris, pH 8,0; 150 mm Nacl; 1 mm EDTA) en gång.

2) Resuspendera bakteriepelleten (från en 10 ml inducerad kultur) i 800ul STE innehållande 100ug/ml lysozym (tillsatt omedelbart före resuspension)

3) inkubera på IS i 15 minuter.

4) Lägg DTT till en slutlig koncentration av 5mM (vi har lager på 1m i -20).

5) Lägg till proteashämmare.

6) bakterier lyseras sedan genom tillsats av N-laurylsarcosine (Sarkosyl) från ett 10% (vikt/volym) lager i STE. Den slutliga koncentrationen av N-laurylsarkosin bör vara 1,5%.

7) Sonikera cellerna i det lilla badet sonicator med för 2 cykler (6min vardera). Sonicatorn stängs automatiskt av efter 6 minuter.

8) Centrifugera lysatet i 5 minuter vid 4 C.

9) överför supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör och tillsätt Triton X-100 (från ett 10% lager tillverkat i STE) till en slutlig koncentration på 2%.

10) Ta 100ul ni-NTA agarosgel och tvätta två gånger genom centrifugering med iskall PBS vid 1000 rpm i 1min. varje

11) Lägg pärlorna i Eppendorf-röret som innehåller lysatet och Triton X-100-röret och inkubera på en nutator eller rocker vid RT i 30-60min.

12) tvätta pärlorna 4X med 1 ml iskall PBS innehållande 20 mm imidiazol vid 1000 rpm i 1 minut vardera.

13) Lägg till 1x laddningsbuffert med 1% BME, koka 3min och analysera på SDS-sida.

anmärkningar för extraktion:

* detta grundläggande protokoll fungerar för FLAG -, GST-och 6HIS epitope-taggar. Det har inte testats för MBP, vilket inte svarar på tvättmedel.

* inkluderingen av Imidiazol är specifik för 6HANS taggar.

*TWEEN20 vid 0,1 – 1% kan också införlivas i tvättbufferten för att minska bakgrunden om det behövs.

lösningar

Laddningsbuffert (för att göra ett 4x lager)

50 mM Tris-HCl; pH 6.8 (2.0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0, 8 g SDS)

10% Glycerol (4, 0 ml 10% Glycerol)

12, 5 mm EDTA (1, 0 ml 0, 5 m EDTA)

0, 02% Bromfenolblått (8 mg Bromfenolblått)

tillsätt färsk 2(eller beta)-merkaptoetanol (BME) till 1% före användning.