Schedllab

Iptg inductie en extractie van eiwitten uit bacteriën

bereid door Swathi Arur en Sudhir Nayak

inductie bij bacteriën kan worden uitgevoerd met behulp van een van de twee basismethoden. Snelle inductie werkt niet voor alle eiwitten en kan je suboptimale opbrengsten geven. De langzame inductie kan de oplosbaarheid van sommige proteã nen verbeteren. De methode die het beste is voor u zal afhangen van uw specifieke eiwit en de toepassing. Als u optimale oplosbaarheid wilt, moeten beide worden getest voordat u opschaalt. Dit protocol wordt gegeneraliseerd en zal variëren gebaseerd op een verscheidenheid van factoren zoals de bacteriële stam, recombinante proteã ne, en ouder plasmide.

snelle inductie

1) uit een relatief verse plaat (<4 weken) Kies een kolonie en groei O/N bij 30C (of 37C) in 1-2ml LB+AMP (of andere selectie) in een 15ml snap cap buis op een rotator of shaker.

2) verdun 1: 50 (1: 100 indien 37C O/N) in 2 ml LB+AMP en groei 3-4 uur bij 37 C in 15 ml snap cap tube in een rotator.

4) Bereid 1 ml LB+AMP+1mm IPTG in een 15 ml conische en voorverwarming tot 37 C ongeveer 10 minuten voor gebruik.

5) Verwijder na 3-4 uur 1 ml van tubes op 37deg C en plaats in geëtiketteerde 1,5 ml tubes. Draai bij max, 30sec, RT, en verwijder supe. Bevriezen pellet op -20 tot nodig. DIT IS DE ONGEÏNDUCEERDE CONTROLE.

6) Voeg voorwarmde 1ml LB + AMP + 1mm IPTG toe aan 15ml snap cap tube en keer 3-4 uur terug naar 37 C. Dit zal het uiteindelijke volume terug te krijgen naar 2ml en de uiteindelijke concentratie van IPTG tot 0,5 mM.

7) Na 3-4hrs transfer 1ml van geïnduceerde monster aan gelabelde 1,5 ml buizen en spin op max, 30sec, RT, en verwijder supe. Bevriezen pellet op -20 tot nodig. DIT IS HET GEÏNDUCEERDE MONSTER.

8) monstervoorbereiding voor SDS-PAGE: voeg 100ul van 1x ladingsbuffer (zie onderstaande oplossingen) met 1% BME toe aan niet-geïnduceerde en geïnduceerde monsters. Vortex voor 10sec tot 1min of totdat er geen klontjes bacteriën zijn. Kook 3-5min, draai bij maximum, 30sec, RT ,en lading 5-25ul (gewoonlijk 10ul) afhankelijk van gel (hoeveelheid eiwit, grootte van pellet, Western, enz.).

langzame inductie

voor langzame inductie van eiwitten volg het snelle inductieprotocol met de volgende veranderingen:

6) Voeg 20 C 1 ml LB+AMP+1mM IPTG toe aan 15 ml snap cap tube en incubeer roterend of schudden bij 20 C gedurende 12-16 uur. Dit zal het uiteindelijke volume terug te krijgen naar 2ml en de uiteindelijke concentratie van IPTG tot 0,5 mM.

7) na 12-16hrs transfer 1ml van geïnduceerde monster aan gelabelde 1,5 ml buizen en spin op max, 30sec, RT, en verwijder supe. Bevriezen pellet op -20 tot nodig. DIT IS HET GEÏNDUCEERDE MONSTER.

opmerkingen voor inductie:

* Inductietijd varieert van 2-5 uur.

* IPTG kan variëren van 0,1-1,0 M.

* als u uw monster te lang kookt, worden ze viskeus door de totale afgifte van cellulair DNA. Je kunt ze nog steeds gebruiken als je een gebied met een lage viscositeit kunt vinden, maar het is meestal beter om het experiment te herhalen.

extractie van oplosbare eiwitten

1) was de bacteriële pellet eenmaal met 2 ml ijskoude STE (10mm Tris, pH 8,0; 150mM Nacl; 1mm EDTA).

2) Resuspendeer de bacteriële pellet (uit een door 10 ml geïnduceerde cultuur) in 800ul STE met 100ug/ml lysozym (toegevoegd onmiddellijk vóór resuspensie)

3) incubeer gedurende 15 minuten op ijs.

4) Voeg DTT toe aan een eindconcentratie van 5 mm ( We hebben voorraden van 1 miljoen in -20).

5) proteaseremmers toevoegen.

6) bacteriën worden vervolgens gelyseerd door toevoeging van n-laurylsarcosine (Sarkosyl) uit een 10% (M/v) voorraad in STE. De uiteindelijke concentratie van n-lauryl sarcosine moet 1,5% zijn.

7) Soniceer de cellen in de sonicator met een klein bad gedurende 2 cycli (elk 6 minuten). De sonicator wordt na 6 minuten automatisch uitgeschakeld.

8) centrifugeer het lysaat gedurende 5 minuten bij 4 C.

9) breng het supernatant over in een nieuwe Eppendorf-buis en voeg Triton X-100 (uit een 10% – voorraad in STE) toe tot een eindconcentratie van 2%.

10) neem 100ul ni-NTA-agarosegel en was tweemaal door centrifugeren met ijskoude PBS bij 1000rpm gedurende 1 min. elke

11) Voeg de parels toe aan de Eppendorf-buis met het lysaat en de Triton X-100-buis en incubeer op een nutator of tuimelaar bij RT gedurende 30-60 minuten.

12) was de kralen 4X met 1 ml ijskoude PBS met 20 mm imidiazol bij 1000rpm gedurende 1 minuut elk.

13) voeg 1X laadbuffer toe met 1% BME, kook 3min en analyseer op SDS-pagina.

opmerkingen voor extractie:

* dit basisprotocol werkt voor FLAG -, GST-en 6HIS epitope-tags. Het is niet getest op MBP, die niet reageert Wil op detergentia.

*het opnemen van Imidiazool is specifiek voor 6HIS tags.

* TWEEN20 op 0,1-1% kan ook worden opgenomen in de wash buffer om de achtergrond te verminderen indien nodig.

Oplossingen

Laden Buffer (een 4X Voorraad)

50 mM Tris-HCl; pH 6.8 (2.0 ml 1 M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% Glycerol (4.0 ml 10% Glycerol)

12,5 mM EDTA (1.0 ml 0,5 M EDTA)

0.02 % Bromophenol Blauw (8 mg Bromophenol Blauw)

Toevoegen vers 2(of beta)-mercaptoethanol (BME) – 1% vóór het gebruik.