Schedl Lab

a Swathi Arur és Sudhir Nayak által készített

baktériumokból származó fehérjék Iptg indukciója és extrakciója a baktériumok indukciója két alapvető módszer egyikével hajtható végre. A gyors indukció nem működik minden fehérje esetében, és nem optimális hozamot eredményezhet. A lassú indukció fokozhatja egyes fehérjék oldhatóságát. Az Ön számára legmegfelelőbb módszer az adott fehérjétől és az alkalmazástól függ. Ha optimális oldhatóságot szeretne, mindkettőt meg kell vizsgálni a méretezés előtt. Ez a protokoll általánosított, és számos tényezőtől függ, mint például a baktériumtörzs, a rekombináns fehérje és a szülő plazmid.

gyors indukció

1) egy viszonylag friss lemezről (< 4 hét) válasszon egy kolóniát, és 30C (vagy 37C) hőmérsékleten növelje az O/N-t 1-2 ml LB+AMP-ban (vagy más szelekcióban) egy 15 ml-es snap cap csőben egy forgatón vagy rázógépen.

2) hígítson 1:50-et (1:100, ha 37C O/N) 2 ml LB+AMP-ben, majd 3-4 órán át növelje 37 C-on 15 ml-es bepattanó csőben egy forgatóban.

4) készítsen elő 1 ml LB+AMP+1 mm-es IPTG-t 15 ml-es kúpos formában, majd használat előtt előmelegítse 37 C-ra körülbelül 10 percig.

5) 3-4 óra elteltével távolítson el 1 ml-t a csövekből 37deg C hőmérsékleten, és helyezze a címkézett 1,5 ml-es csövekbe. Spin Max, 30sec, RT, és távolítsa el supe. Fagyassza le a pelletet -20-on, amíg szükséges. EZ AZ UNINDUCED CONTROL.

6) adjon előmelegített 1 ml LB+AMP+1 mm-es IPTG-t a 15 ml-es snap cap csőhöz, majd térjen vissza 37 C-ra 3-4 órán keresztül. Ez a végső térfogatot 2 ml-re, az IPTG végső koncentrációját pedig 0,5 mM-re állítja vissza.

7) 3-4 óra elteltével 1 ml-t viszünk át az indukált mintából a címkézett 1,5 ml-es csövekbe, és centrifugáljuk max, 30 másodperc, RT, és távolítsuk el a supe-t. Fagyassza le a pelletet -20-on, amíg szükséges. EZ AZ INDUKÁLT MINTA.

8) minta előkészítése SDS-oldalhoz: adjon hozzá 100ul 1x betöltő puffert (lásd az alábbi oldatokat) 1% BME-vel a nem indukált és indukált mintákhoz. Vortex 10 másodperctől 1 percig, vagy amíg nincsenek baktériumcsomók. Forraljuk 3-5 perc, spin Max, 30sec, RT, és terhelés 5-25ul (általában 10ul) függően gél (fehérje mennyisége, mérete pellet, nyugati, stb.).

lassú indukció

a fehérje lassú indukciójához kövesse a gyors indukciós protokollt a következő változtatásokkal:

6) adjunk hozzá 20 C 1 ml LB+AMP+1 mm-es IPTG-t a 15 ml-es snap cap csőhöz, majd inkubáljuk 20 C-on forgatva vagy rázva 12-16 órán keresztül. Ez a végső térfogatot 2 ml-re, az IPTG végső koncentrációját pedig 0,5 mM-re állítja vissza.

7) 12-16 óra elteltével 1 ml-t viszünk át az indukált mintából a címkézett 1,5 ml-es csövekbe, és centrifugáljuk max, 30 másodperc, RT, és távolítsuk el a supe-t. Fagyassza le a pelletet -20-on, amíg szükséges. EZ AZ INDUKÁLT MINTA.

megjegyzések az indukcióhoz:

*az indukciós idők 2-5 óra között változnak.

* az IPTG 0,1-1,0 m között változhat.

*ha túl sokáig forralja a mintát, akkor a sejt DNS teljes felszabadulásától viszkózus lesz. Továbbra is használhatja őket, ha alacsony viszkozitású területet talál, azonban általában jobb, ha csak megismétli a kísérletet.

oldható fehérjék extrakciója

1) mossa le a bakteriális pelletet 2 ml jéghideg STE-vel (10 mm-es Tris, pH 8,0; 150 mm-es Nacl; 1 mm-es EDTA) egyszer.

2) A baktériumpelletet (10 ml-es indukált tenyészetből) Reszuszpendáljuk 800ul STE-ben, amely 100ug/ml lizozimot tartalmaz (közvetlenül a reszuszpendálás előtt adjuk hozzá)

3) inkubáljuk jégen 15 percig.

4) Adja hozzá a DTT-t az 5 mm-es végső koncentrációhoz ( 1 m-es készleteink vannak -20-ban).

5) adjon hozzá proteázgátlókat.

6) a baktériumokat ezután az STE 10%-os (m/v) állományából származó N-lauril-szarkozin (Sarkosil) hozzáadásával lizálják. Az N-lauril-szarkozin végső koncentrációjának 1,5% – nak kell lennie.

7) Szonikálja a sejteket a kis fürdő szonikátorban 2 cikluson keresztül (mindegyik 6 perc). A sonicator 6 perc elteltével automatikusan kikapcsol.

8) centrifugáljuk a lizátumot 5 percig 4 C-on.

9) vigyük át a felülúszót egy új eppendorf csőbe, és adjuk hozzá a Triton X-100-at (az STE-ben Gyártott 10% – os készletből) 2% – os végső koncentrációra.

10) Vegyünk 100ul Ni-NTA agaróz gélt, és kétszer mossuk centrifugálással jéghideg PBS-sel 1000 fordulat / perc sebességgel 1 percig. mindegyik

11) adja hozzá a gyöngyöket a lizátumot és a Triton X-100 csövet tartalmazó eppendorf csőhöz, és inkubálja egy nutator vagy rocker RT-n 30-60 percig.

12) mossa le a gyöngyöket 4X 1 ml jéghideg PBS-vel, amely 20 mm-es imidiazolt tartalmaz 1000 fordulat / perc sebességgel, egyenként 1 percig.

13) adjon hozzá 1X betöltő puffert 1% BME-vel, forraljon 3 percet, és elemezze az SDS-oldalon.

megjegyzések a kibontáshoz:

*ez az alapvető protokoll a FLAG, a GST és a 6his epitóp címkékhez fog működni. Nem tesztelték az MBP-t,amely nem reagál a mosószerekre.

* az Imidiazol felvétele a 6his címkékre jellemző.

*a TWEEN20 0,1-1% – on is beépíthető a mosópufferbe, hogy szükség esetén csökkentse a hátteret.

megoldások

betöltő puffer (4x készlet készítéséhez)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0, 8 g SDS)

10% glicerin (4, 0 ml 10% glicerin)

12, 5 mM EDTA (1, 0 ml 0, 5 M EDTA)

0, 02% Brómfenol kék (8 mg Brómfenol Kék)

friss 2(vagy béta)-merkaptoetanol (BME) használata előtt 1% – ra.