Schedl Lab

Swathi ArurとSudhir Nayakによって調製された細菌からのタンパク質のIPTG誘導と抽出

細菌における誘導は、二つの基本的な方法のいずれかを用いて行 速い誘導はすべての蛋白質のために働かないし、最適以下の収穫を与えることができる。 遅い誘導はある蛋白質の容解性を高めることができます。 あなたのために最もよい方法はあなたの特定の蛋白質および適用によって決まる。 最適な溶解度が必要な場合は、スケールアップする前に両方をテストする必要があります。 このプロトコルは一般化されており、細菌株、組換えタンパク質、および親プラスミドなどの様々な要因に基づいて変化する。

高速誘導

1)比較的新鮮なプレートから(<4週間)コロニーを選び、30℃(または37℃)で1-2ml LB+AMP(または他の選択)で15mlスナップキャップチューブ内

2)1:50(1:100IF37C O/N)を2ml LB+AMPで希釈し、37℃で3-4時間成長させます。

4)1ml LB+AMP+1mm IPTGを15ml円錐形で準備し、使用の前に37Cに約10分前に予備加熱して下さい。

5)3-4hrs後37deg Cで管から1mlを取除き、分類された1.5ml管に置いて下さい。 最高、30sec、RTで回転し、supeを取除いて下さい。 必要とされるまでの-20の氷結の餌。 これは誘導されていないコントロールです。

6)予め温めた1ml LB+AMP+1mm IPTGを15mlスナップキャップチューブに加え、37℃に3-4時間戻します。 これにより、最終体積は2mlに戻り、IPTGの最終濃度は0.5mMになります。

7)3-4hrs後、誘導サンプルから1mlを標識された1.5mlチューブに移し、最大、30秒、RTで回転させ、supeを除去します。 必要とされるまでの-20の氷結の餌。 これが誘導されたサンプルです。

8)SDS-PAGEのサンプル調製:100ulの1xローディング緩衝液(下記の溶液を参照)に1%BMEを添加して、誘導されていないサンプルと誘導されたサンプルに加えます。 10secから1minのためのまたは細菌の群生がないまでの渦。 ゲル（蛋白質の量、餌のサイズ、西部、等）によって最高の3-5min、回転、30sec、RT、および負荷5-25ul（通常10ul）を沸かして下さい。).

遅い誘導タンパク質の遅い誘導のための

以下の変更を伴う高速誘導プロトコルに従ってください:

6)15mlスナップキャップチューブに20℃1ml LB+AMP+1mm IPTGを加え、20℃で12-16時間回転または振盪する。 これにより、最終体積は2mlに戻り、IPTGの最終濃度は0.5mMになります。

7）12-16hrs後、誘導サンプルから1mlを標識された1.5mlチューブに移し、最大、30秒、RTで回転させ、supeを除去します。 必要とされるまでの-20の氷結の餌。 これが誘導されたサンプルです。

誘導のためのノート:

*誘導時間は2-5hrsから変わります。

*IPTGは0.1-1.0Mから変えることができます。

*サンプルを長時間沸騰させると、細胞DNAの総放出から粘性になります。 あなたは低粘度の領域を見つけることができれば、あなたはまだそれらを使用することができますが、通常は実験を繰り返す方が良いです。

可溶性タンパク質の抽出

1)2mlの氷冷STE(10mm Tris,pH8.0;150mm Nacl;1mm EDTA)で細菌ペレットを一度洗浄する。

2)100ug/mlのリゾチームを含む800ulのSTEに細菌ペレット（10ml誘導培養由来）を再懸濁させる（再懸濁直前に添加する）

3)氷上で15分間インキュベートする。

4)DTTを5mmの最終濃度に添加します(-20で1Mの在庫があります)。

5)プロテアーゼ阻害剤を添加する。

6)Steの10%(w/v)株からN-laurylsarcosine(Sarkosyl)を添加することにより、細菌を溶解する。 N-ラウリルサルコシンの最終濃度は1.5％でなければならない。

7)小さなバスソニケータで細胞を2サイクル（各6分）のために超音波処理します。 Sonicatorは6分後に自動的に消えます。

8)溶解液を4℃で5分間遠心分離します。

9)上清を新しいeppendorfチューブに移し、Triton X-100(STE製10%ストックから)を最終濃度2%に加えます。

10)Ni-NTAアガロースゲル100ulを取り、氷冷PBSで1000rpmで1分間遠心分離して二回洗浄する。 それぞれ

11)ライセートとTriton X-100チューブを含むeppendorfチューブにビーズを加え、nutatorまたはロッカー上でRTで30-60分間インキュベートする。

12)ビーズ4Xを20mmイミジアゾールを含む1mlの氷冷PBSで1000rpmでそれぞれ1分間洗浄する。

13)1%BMEの1Xローディングの緩衝を加え、3minを沸かし、SDS-PAGEで分析して下さい。

抽出のための注意事項:

*この基本プロトコルは、FLAG、GST、および6HISエピトープタグで動作します。 それは洗剤に意志を答えないMBPのためにテストされませんでした。

*イミジアゾールの包含は6HIS札に特定です。

*0.1-1%のTWEEN20はまた背景を減らすために洗浄緩衝に必要であれば組み込むことができる。

溶液

ローディングバッファー(4Xストックを作るため)

50mMトリス-HCl;pH6.8(2.0ml1Mトリス-HCl;pH6.8)6.8)

2% SDS(0.8g SDS)

10%グリセロール(4.0ml10%グリセロール)

12.5mM EDTA(1.0ml0.5M EDTA)

0.02%ブロモフェノールブルー(8mgブロモフェノールブルー)

新鮮な2(ま）を使用する前に1％に。