Schedl Lab

indução e extracção de proteínas da bactéria

preparada por Swathi Arur e Sudhir Nayak

indução em bactérias pode ser realizada utilizando um de dois métodos básicos. Indução rápida não funciona para todas as proteínas e pode dar-lhe rendimentos suboptimais. A indução lenta pode aumentar a solubilidade de algumas proteínas. O método que é melhor para você dependerá de sua proteína particular e da aplicação. Se quiser uma solubilidade óptima, ambos devem ser testados antes de serem dimensionados. Este protocolo é generalizado e irá variar com base numa variedade de factores como a estirpe bacteriana, proteína recombinante e plasmídeo Progenitor.

indução rápida

1) a partir de uma placa relativamente fresca (<4 semanas) escolher uma colónia e crescer O/N A 30C (ou 37C) em 1-2 ml LB+AMP (ou outra selecção) num tubo de fecho de 15 ml num rotador ou agitador.

2) diluir 1: 50 (1: 100 se 37C o/N) em 2 ml LB+AMP e crescer 3-4 horas a 37 C em tubo de fecho de 15 ml num rotador.

4) preparar 1 ml LB+AMP+1mM IPTG num sistema cónico de 15 ml e pré-lavagem a 37 C cerca de 10min antes de utilizar.

5) após 3-4 horas remover 1 ml de tubos a 37deg C e colocar em tubos rotulados de 1, 5 ml. Girar no máximo, 30sec, RT, e remover supe. Congelar a cápsula a -20 até ser necessário. ESTE É O CONTROLO NÃO INDUZIDO.

6) Adicione prewarmed 1 ml LB+AMP+1mM IPTG ao tubo snap cap de 15 ml e regresse a 37 C durante 3-4 horas. Isto fará com que o volume final volte para 2ml e a concentração final de IPTG para 0, 5 mM.

7) após 3-4hrs Transferir 1ml da amostra induzida para tubos rotulados de 1, 5 ml e rodar no máximo, 30sec, RT, e remover supe. Congelar a cápsula a -20 até ser necessário. ESTA É A AMOSTRA INDUZIDA.

8) preparação da amostra para a SDS-PAGE: adicionar 100ul de tampão de carga 1X (ver soluções abaixo) com 1% de EM às amostras não induzidas e induzidas. Vortex para 10sec a 1min ou até não haver aglomerados de bactérias. Ferver 3-5min, girar no máximo, 30sec, RT, e carga 5-25ul (geralmente 10ul) dependendo do gel (quantidade de proteína, Tamanho do pellet, Oeste, etc.).

indução lenta

para indução lenta de proteínas seguir protocolo de indução rápida com as seguintes alterações:

6) Adicionar 20 C 1 ml LB+AMP+1mM IPTG ao tubo de fecho de abertura de 15 ml e incubar a rotação ou agitação a 20 C durante 12-16 horas. Isto fará com que o volume final volte para 2ml e a concentração final de IPTG para 0, 5 mM.

7) após 12-16hrs Transferir 1ml da amostra induzida para tubos rotulados de 1, 5 ml e rodar no máximo, 30sec, RT, e remover supe. Congelar a cápsula a -20 até ser necessário. ESTA É A AMOSTRA INDUZIDA.

notas para indução:

* os tempos de indução variam de 2-5hrs.

* a IPTG pode ser variada de 0, 1-1, 0 M.

*Se ferver a sua amostra durante demasiado tempo, Esta tornar-se-á viscosa a partir da libertação total de ADN celular. Você ainda pode usá-los se você pode encontrar uma área de baixa viscosidade, no entanto, geralmente é melhor apenas para repetir a experiência.

extracção de proteínas solúveis

1) Lavar o sedimento bacteriano com 2mls de STE gelado (Tris de 10 mm, pH 8.0; NaCl de 150 mm; EDTA de 1 mm) uma vez.

2) Ressuspender o pellet bacteriano (a partir de um 10ml induzida cultura) no 800ul de STE contendo 100ug/ml de Lisozima (adicionado imediatamente antes de ressuspensão)

3) Incubar no gelo por 15 minutos.

4) Adicionar TDT a uma concentração final de 5mM (temos stocks a 1M em -20).

5) adicionar inibidores da protease.

6) As bactérias são então lisadas pela adição de N-laurilsarcosina (Sarkosil) de um estoque de 10% (w/v) em STE. A concentração final de N-lauril sarcosina deve ser de 1,5%.

7) Sonicate as células no pequeno sonicador de banho com durante 2 ciclos (6min cada). O sonicador desliga-se automaticamente ao fim de 6 minutos.

8) Centrífuga, o lisado por 5min a 4 C.

9) Transferir o sobrenadante para um novo tubo eppendorf e adicionar o Triton X-100 (10% de caldo feito em STE) para uma concentração final de 2%.

10) tomar 100ul de gel de agarose Ni-neta e lavar duas vezes por centrifugação com PBS a 1000rpm durante 1min. cada

11) adicionar as esferas ao tubo eppendorf contendo o lisato e o tubo Triton X-100 e incubar numa nutadora ou roqueiro na TR durante 30-60min.

12) lavar as contas 4X com 1 ml de PBS a frio com imidiazole de 20 mm às 1000 RPM para cada um dos 1Minutos.

13) adicionar um buffer de carga 1X COM 1% BME, ferver 3min, e analisar na página SDS.

notas para extração:

*este protocolo básico vai funcionar para FLAG, GST, e 6 suas marcas epítopos. Não foi testado o MBP, que não responde à vontade dos detergentes.

* a inclusão do Imidiazole é específica das 6 marcas.

* TWEEN20 a 0, 1-1% também pode ser incorporado no tampão de lavagem para reduzir o fundo, se necessário.

Soluções

Loading Buffer (Para fazer um 4X de Ações)

50 mM de Tris-HCl; pH de 6,8 (2,0 ml de 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% ficha de dados de segurança (0,8 g SDS)

10% de Glicerol (4.0 ml 10% de Glicerol)

12,5 mM de EDTA (1,0 ml 0,5 M EDTA)

0.02 % Bromophenol Blue (8 mg Bromophenol Blue)

Adicionar novo 2(ou beta)-mercaptoethanol (BME) a 1% antes de usar.