Schedl Lab

inducția IPTG și extracția proteinelor din bacterii

preparate de Swathi arur și Sudhir Nayak

inducția în bacterii poate fi efectuată utilizând una din cele două metode de bază. Inducția rapidă nu funcționează pentru toate proteinele și vă poate oferi randamente suboptime. Inducția lentă poate spori solubilitatea unor proteine. Metoda care este cea mai bună pentru dvs. va depinde de proteina dvs. particulară și de aplicație. Dacă doriți o solubilitate optimă, ambele trebuie testate înainte de scalare. Acest protocol este generalizat și va varia în funcție de o varietate de factori, cum ar fi tulpina bacteriană, proteina recombinantă și plasmida părinte.

inducție rapidă

1) dintr-o placă relativ proaspătă (<4 săptămâni) alegeți o colonie și creșteți O/n la 30c (sau 37C) în 1-2ml lb+AMP (sau altă selecție) într-un tub de 15ml snap cap pe un rotator sau agitator.

2) diluați 1:50 (1:100 dacă 37C O/N) în 2ml lb+AMP și creșteți 3-4 ore la 37 C în 15ml snap cap tube într-un rotator.

4) Pregătiți 1ml LB+AMP+1mm IPTG într-un Conic de 15 ml și preîncălzit la 37 C aproximativ 10min înainte de utilizare.

5) după 3-4 ore, îndepărtați 1 ml din tuburi la 37deg C și puneți-le în tuburi marcate cu 1,5 ml. Spin la max, 30sec, RT, și scoateți supe. Congelați peletele la -20 până când este necesar. ACESTA ESTE CONTROLUL NEINDUS.

6) Adăugați pre-încălzit 1ml lb+AMP+1mm IPTG la 15ml snap cap tub și a reveni la 37 C timp de 3-4 ore. Acest lucru va readuce volumul final la 2ml și concentrația finală de IPTG la 0,5 mM.

7) după 3-4hrs transferați 1 ml din proba indusă în tuburi etichetate de 1,5 ml și rotiți la max, 30sec, RT și îndepărtați supe. Congelați peletele la -20 până când este necesar. ACEASTA ESTE PROBA INDUSĂ.

8) pregătirea eșantionului pentru SDS-PAGE: adăugați 100ul de tampon de încărcare 1X (a se vedea soluțiile de mai jos) cu 1% BME la probele neinduse și induse. Vortex pentru 10sec la 1min sau până când nu există aglomerări de bacterii. Se fierbe 3-5min, se rotește la max, 30sec, RT și se încarcă 5-25ul (de obicei 10ul) în funcție de gel (cantitatea de proteine, dimensiunea peletei, Western etc.).

inducție lentă

pentru inducerea lentă a proteinelor urmați protocolul de inducție rapidă cu următoarele modificări:

6) Adăugați 20 C 1ml lb+AMP+1mm IPTG la 15ml snap cap tube și incubați rotirea sau agitarea la 20 C timp de 12-16 ore. Acest lucru va readuce volumul final la 2 ml și concentrația finală de IPTG la 0,5 mM.

7) după 12-16hrs transferați 1 ml din proba indusă în tuburile etichetate de 1,5 ml și rotiți la max, 30sec, RT și îndepărtați supe. Congelați peletele la -20 până când este necesar. ACEASTA ESTE PROBA INDUSĂ.

note pentru inducție:

*timpii de inducție variază de la 2 la 5 ore.

* IPTG poate varia de la 0,1-1,0 M.

*dacă fierbeți proba prea mult timp, aceasta va deveni vâscoasă din cauza eliberării totale de ADN celular. Le puteți folosi în continuare dacă puteți găsi o zonă cu vâscozitate scăzută, cu toate acestea, de obicei, este mai bine doar să repetați experimentul.

extracția proteinelor solubile

1) Spălați peleta bacteriană cu 2 ml de gheață rece ste (10mm Tris, pH 8,0; 150mm NaCl; 1mm EDTA) o dată.

2) omogenizați peleta bacteriană (dintr-o cultură indusă de 10 ml) în 800ul de STE conținând 100ug/ml de lizozim (adăugat imediat înainte de omogenizare)

3) incubați pe gheață timp de 15 minute.

4) Adăugați TDT la o concentrație finală de 5 mm ( avem stocuri la 1m în -20).

5) Adăugați inhibitori de protează.

6) bacteriile sunt apoi lizate prin adăugarea de n-laurilsarcozină (Sarkosil) dintr-un stoc de 10% (g/v) în STE. Concentrația finală de n-lauril sarcozină trebuie să fie de 1,5%.

7) Sonicate celulele din sonicator baie mică cu timp de 2 cicluri (6min fiecare). Sonicatorul se oprește automat după 6 minute.

8) centrifugați lizatul timp de 5 minute la 4 C.

9) transferați supernatantul într-un tub eppendorf nou și adăugați Triton X-100 (dintr-un stoc de 10% fabricat în STE) la o concentrație finală de 2%.

10) Luați 100ul de gel de agaroză Ni-NTA și spălați de două ori prin centrifugare cu PBS rece ca gheața la 1000 RPM timp de 1min. fiecare

11) Se adaugă mărgelele în tubul eppendorf care conține lizatul și tubul Triton X-100 și se incubează pe un nutator sau rocker la RT timp de 30-60min.

12) spălați mărgelele 4X cu 1 ml PBS rece ca gheața conținând 20 mm imidiazol la 1000 RPM pentru 1 minut fiecare.

13) adăugați 1x tampon de încărcare cu 1% BME, se fierbe 3min, și analiza pe SDS-PAGE.

note pentru extracție:

*acest protocol de bază va funcționa pentru etichetele epitope FLAG, GST și 6his. Nu a fost testat pentru MBP, care nu răspunde voinței la detergenți.

*includerea Imidiazolului este specifică pentru 6etichetele sale.

*TWEEN20 la 0,1-1% poate fi, de asemenea, încorporat în tamponul de spălare pentru a reduce fundalul, dacă este necesar.

soluții

tampon de încărcare (pentru a face un stoc 4X)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% glicerol (4,0 ml 10% glicerol)

12,5 mm EDTA (1,0 ml 0,5 m EDTA)

0,02% albastru de Bromofenol (8 mg albastru de Bromofenol)

se adaugă 2(sau beta)-mercaptoetanol (BME) la 1% înainte de utilizare.