Schedl Lab

Indukce IPTG a Extrakci Proteinů z Bakterií

Připravené Swathi Arur a Sudhir Nayak

Indukce v bakteriích lze provést pomocí jedné ze dvou základních metod. Rychlá indukce nefunguje pro všechny proteiny a může vám poskytnout suboptimální výnosy. Pomalá indukce může zvýšit rozpustnost některých proteinů. Metoda, která je pro vás nejlepší, bude záviset na konkrétním proteinu a aplikaci. Pokud chcete optimální rozpustnost, oba by měly být testovány před zvětšováním. Tento protokol je zobecněn a bude se lišit v závislosti na různých faktorech, jako je bakteriální kmen, rekombinantní protein a mateřský plasmid.

Rychlé indukce

1) Z poměrně čerstvé desky (<4 týdny) pick kolonie a růst O/N při 30 ° c (nebo 37C) v 1-2 ml LB+AMP (nebo jiné výběr) v 15ml snap cap trubice na rotátoru nebo šejkr.

2) zřeďte 1:50 (1: 100, pokud 37C O / N) v 2ml LB+AMP a růst 3-4 hodiny při 37 C v 15ml snap cap zkumavce v rotátoru.

4) Připravte 1ml LB + AMP+1mM IPTG v 15ml kuželovitém a předehřátém na 37 ° C asi 10 minut před použitím.

5) po 3-4 hodinách vyjměte 1 ml z zkumavek při 37 ° C a vložte do označených 1,5 ml zkumavek. Točení při max, 30sec, RT, a odstranit supe. Zmrazte peletu na -20, dokud není potřeba. TOTO JE NEINDUKOVANÁ KONTROLA.

6) Přidejte předehřátý 1ml LB+AMP+1mM IPTG do 15ml snap cap trubice a vraťte se do 37 C po dobu 3-4 hodin. To bude mít konečný objem zpět do 2 ml a výsledná koncentrace IPTG 0,5 mM.

7) Po 3-4 hodiny, převod 1 ml z vyvolané vzorku do označené 1,5 ml zkumavky a točit na max, 30 sekund, RT, a odstranit supe. Zmrazte peletu na -20, dokud není potřeba. TOTO JE INDUKOVANÝ VZOREK.

8) příprava vzorků pro SDS-PAGE: přidejte 100ul 1x zátěžového pufru (viz roztoky níže) s 1% BME k neindukovaným a indukovaným vzorkům. Vír po dobu 10 sekund až 1 minuty nebo dokud nejsou žádné shluky bakterií. Vařte 3-5min, odstřeďujte při max, 30sec, RT a vložte 5-25ul (obvykle 10ul) v závislosti na gelu (množství bílkovin, velikost pelet, Západní atd.).

pomalá indukce

pro pomalou indukci proteinu postupujte podle protokolu rychlé indukce s následujícími změnami:

6) Přidejte 20 C 1 ml LB + AMP+1 mm IPTG do 15 ml snap cap trubice a inkubujte rotující nebo třepání při 20 ° C po dobu 12-16 hodin. To bude mít konečný objem zpět do 2 ml a výsledná koncentrace IPTG 0,5 mM.

7) Po 12-16hrs převod 1 ml z vyvolané vzorku do označené 1,5 ml zkumavky a točit na max, 30 sekund, RT, a odstranit supe. Zmrazte peletu na -20, dokud není potřeba. TOTO JE INDUKOVANÝ VZOREK.

poznámky pro indukci:

*indukční časy se liší od 2-5hrs.

* IPTG se může měnit od 0,1 do 1,0 m.

* pokud vaříte vzorek příliš dlouho, stane se viskózní z celkového uvolnění buněčné DNA. Stále je můžete použít, pokud najdete oblast s nízkou viskozitou, je však obvykle lepší opakovat experiment.

Extrakce Rozpustných Proteinů

1) Umýt bakteriální pelety s 2mls ledové STE (10mM Tris, pH 8.0; 150 mm Nacl; 1 mm EDTA) jednou.

2) Resuspendujte bakteriální peletu (10 ml indukované kultury) v 800ul STE obsahující 100ug/ml Lysozymu (přidány bezprostředně před promíchání)

3) Inkubovat na ledu po dobu 15 minut.

4) Přidejte DTT na konečnou koncentraci 5 mm (máme zásoby na 1M v -20).

5) Přidejte inhibitory proteázy.

6) bakterie se pak lyzují přidáním N-laurylsarkosinu (Sarkosyl) z 10% (w/v) zásoby v STE. Konečná koncentrace N-lauryl sarkosinu by měla být 1,5%.

7) Sonikujte buňky v malém sonikátoru lázně po dobu 2 cyklů (každý po 6 minutách). Sonikátor se automaticky vypne po 6 minutách.

8) Odstředí lyzátu za 5min na 4 ° C.

9) převeďte supernatant do nové mikrozkumavky a přidat Triton X-100 (z 10% populace vyrobené v STE) na konečnou koncentraci 2%.

10) Vzít 100ul z Ni-NTA agarózy gel a umýt dvakrát odstředěním s ledovým PBS na 1000 ot / min pro 1min. každý

11) Přidat korálky do mikrozkumavky obsahující lyzátu a Triton X-100 zkumavky a inkubovat na nutator nebo rocker na RT po dobu 30-60min.

12) perličky 4x omyjte 1 ml ledově studeného PBS obsahujícího 20mM imidiazol při 1000 ot / min po dobu 1 minuty.

13) přidejte 1x vyrovnávací paměť s 1% BME, vařte 3min a analyzujte na stránce SDS.

poznámky pro extrakci:

*tento základní protokol bude fungovat pro značky FLAG, GST a 6HIS epitope. Nebyl testován na MBP, který nereaguje na detergenty.

* zahrnutí Imidiazolu je specifické pro 6jeho značky.

* TWEEN20 při 0,1-1% může být také začleněn do mycího pufru, aby se v případě potřeby snížilo pozadí.

Řešení

Loading Buffer (4X Skladem)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0,8 g SDS)

10% Glycerol (4.0 ml 10% Glycerolu)

12,5 mM EDTA (1,0 ml 0,5 M EDTA)

0.02 % Bromfenolová Modř (8 mg Bromfenolová Modř)

Přidat čerstvé 2(nebo beta)-merkaptoethanolu (BME) na 1% před použitím.